喻雪琴，张诗琬，陈芳，陈星，戢敏，梅怡晗，梅小平

（1.川北医学院附属医院 感染科，四川 南充 637000；2.首都医科大学，北京 100069）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是我国目前面临的重大公共卫生问题之一，HBV感染后可形成急性乙型肝炎，部分急性肝炎会形成慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB），甚至可发展为肝衰竭、肝硬化及原发性肝癌。我国年均约有50万人死于HBV感染所致肝病[1]。研究结果显示，HBV是通过诱导机体发生一系列免疫反应来介导肝组织炎症反应、肝纤维组织形成及肝细胞癌的发生[2]。目前，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子 -3（T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3,Tim-3）和程序性死亡受体 -1（programmed cell death protein 1,PD-1）在免疫细胞表面的广泛表达成为对HBV相关性肝病研究的热点之一。PD-1有2个配体，即PD-L1和PD-L2。PD-1可广泛表达于活化的T淋巴细胞、单核细胞、DC等细胞表面，但在NK细胞表面一般不表达或低水平表达。研究结果显示[3]，PD-1在病毒感染、免疫性疾病及肿瘤免疫逃逸中发挥调控作用，PD-1在与其配体结合后可降低T淋巴细胞表面受体介导的抗原信号强度，进而发挥免疫负性调控作用。PD-1通过调控免疫应答来调控过度、持久的免疫反应，进而减轻机体组织的免疫损伤，但这种免疫抑制作用可衰竭CD8+T细胞的数量与功能，造成机体对病原体的清除能力下降和病原体的持续表达[4]。研究表明，Tim基因共有8个，编码4种蛋白，在人类编码3种蛋白Tim-1、Tim-3和Tim-4中，Tim-3是一种适应性免疫负性调节因子，广泛表达于活化的T淋巴细胞、单核细胞及NK细胞，通过与Tim-3配体结合参与免疫反应的调控作用[5]。Tim-3在T淋巴细胞表面表达失衡与HBV感染者自身免疫功能紊乱等关系密切[6]。为此，本研究通过检测HBV相关性肝病患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）表面 Tim-3、PD-1表达水平来探讨Tim-3、PD-1在其发生、发展过程中的相关性，为HBV相关性肝病患者临床免疫治疗提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1～12月川北医学院附属医院HBV相关性肝病患者120例为观察组。诊断标准参照2015年中华医学会肝病学分会制定的慢性乙型肝炎防治指南[7]。观察组中，HBV携带者20例（HBV携带组）。其中，男性12例，女性8例；年龄18～66岁，平均（38.122±15.607）岁。CHB患者30例（CHB组）。其中，男性25例，女性5例；年龄18～68岁，平均（39.260±14.981）岁。重型乙型肝炎患者20例（重型乙型肝炎组）。其中，男性13例，女性7例；年龄18～60岁，平均（37.766±15.450）岁。乙肝肝硬化患者30例（乙肝肝硬化组）。其中，男性19例，女性11例；年龄18～61岁，平均（38.981±15.232）岁。肝细胞癌患者20例（肝细胞癌组）。其中，男性14例，女性6例；年龄18～67岁，平均（39.975±14.550）岁。以该院同期的20例HBsAg（-）健康体检者为健康对照组。其中，男性12例，女性8例；年龄18～64岁，平均（37.980±14.418）岁。观察组与健康对照组在年龄、性别构成比等方面差异无统计学意义（P ＞0.05）。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①患者需知情同意；②HBV感染后肝病诊断需符合中华医学会制定的2015年版的慢性乙型肝炎防治指南标准；③入院时未接受免疫调节与抗病毒治疗。排除标准：①合并其他嗜肝病毒感染及其他原因所致的肝组织炎症；②合并其他疾病。

1.3 仪器与试剂

ADVIA 2400型全自动生化分析仪购自美国Beckman-Coulter公司，BIO-Rad实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司，FACS Calibur流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。HBV感染标志物试剂盒购自美国雅培公司，PBS溶液购自美国Hyclone公司，多聚甲醛试剂盒购自美国Sigma公司，PD-1试剂盒购自美国eBioscience公司，鼠抗人Tim-3-PE荧光素标记单克隆抗体购自美国BioLegend公司，肝功能检测试剂盒购自上海蓝怡科技有限公司。

1.4 检测方法

1.4.1 PBMCs分离采用 Ficol-Hypaque 密度离心法分离PBMCs，取有肝素钠抗凝采血管采集患者空腹全血并离心后去血浆，然后用PBS稀释一倍，加至淋巴细胞分离液上层，2 500 r/min 离心 25 min，取中间白膜层（单核细胞和淋巴细胞富集层），PBS再洗涤2次可获取PBMCs。

1.4.2 PBMCs表面PD-1 表达水平检测 取 3 MIU PBMCs 加入 40 μl FcR Blocing Rergent，4℃避光孵育20 min，以流式洗液洗涤细胞1次，加入lin 1-FITC、HLA-DR-perCP、CD11c-APC，PD-L1-PE或其相应的同型流式着色，4℃避光孵育20 min，用流式洗液洗涤细胞1次，用1%的多聚甲醛溶液固定，mDCs表面特征性标志为 CD11c high HLA-DR lin-1。

1.4.3 PBMCs表面Tim-3 表达水平检测 取 3 MIU PBMCs加入流式CD16、CD56和Tim-3以及单标和同型对照标志物，取4%多聚甲醛溶液500 μl固定后上机检测。

1.4.4 HBV感染标志物及肝功能检测 HBV 感染标志物的检测采用化学发光法；实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA水平；采用ADVIA 2400全自动生化分析仪检测肝功能指标。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例表示，比较采用χ2检验；采用Pearson分析PD-1、Tim-3与其他指标间的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平比较

健康对照组外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平最低，与HBV携带组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），随着病情加重，其PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平逐渐升高，在重型乙型肝炎组、肝细胞癌组中最高，各HBV相关性肝病患者组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平与健康对照组、HBV携带组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 HBV相关性肝病患者PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平与HBV DNA载量、ALT、AST表达水平的相关性分析

HBV相关性肝病患者PBMCs表面Tim-3表达水平与 HBV DNA 载量呈负相关（P＜0.05），与 ALT、AST水平均呈正相关（P＜0.05）；HBV相关性肝病患者PBMCs表面PD-1表达水平与HBV DNA载量呈负相关（P＜0.05），与 ALT、AST 水平呈正相关（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平的相关性分析

HBV相关性肝病患者总体PBMCs表面Tim-3的表达水平与PD-1表达水平呈正相关（r =0.967，P =0.000）。重型乙型肝炎、CHB、乙肝肝硬化患者PBMCs表面Tim-3表达水平与PD-1表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表1 各组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平比较（ng/ml，±s）

表1 各组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平比较（ng/ml，±s）

注：†与健康对照组、HBV携带组比较，P＜0.05。

组别 n Tim-3 PD-1健康对照组 20 1.675±0.488 8.330±0.965 HBV携带组 20 1.735±0.442 8.360±4.102 CHB组 30 6.907±0.645† 44.460±5.995†乙肝肝硬化组 30 8.890±1.189† 59.267±7.422†重型乙型肝炎组 20 11.410±3.037† 68.335±5.724†肝细胞癌组 20 11.210±1.998† 68.340±9.147†F 值 649.651 1 617.655 P值 0.000 0.000

表2 HBV相关性肝病患者PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平与HBV DNA载量、ALT、AST表达水平的相关性分析

表3 各组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平的相关性分析

3 讨论

HBV相关性肝病患者存在特异性免疫功能紊乱或处于免疫耐受状态，导致机体不能及时清除HBV而发生感染慢性化，激活的特异性淋巴细胞才能清除HBV，树突状细胞的抗原呈递作用是激发免疫反应发生的重要环节[8-9]。HBV相关性肝病患者的发病主要通过对肝细胞的免疫损伤来完成，机体免疫调节主要通过T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞等及其分泌的细胞因子来实现，而CD4+T淋巴细胞和CD8+T毒性T淋巴细胞数量和功能改变影响着HBV相关性肝病患者机体的免疫应答能力。研究结果显示[8]，T淋巴细胞表面存在双信号通路，在受到HBV等信号刺激后被激活：①T细胞识别树突状细胞的MHC及MHC结合的抗原肽产生第一信号；②T细胞的受体CD28与树突状细胞上的B7结合产生第二信号，即共刺激信号，是T细胞抗原特异性激活的关键信号通路。在多共刺激信号通路中，负向协同的共刺激分子PD-1在与其相应配体结合后，抑制T细胞增殖、活化与分化。Tim-3在HBV感染后的HBV相关性肝病患者中发挥着对免疫功能负向调控作用，Tim-3与半乳糖凝素-9结合，为T淋巴细胞提供负性共刺激信号受体与信号通路，介导Th1细胞凋亡或抑制Th1细胞活性，从而降低促炎因子产生，同时通过对Th17细胞的抑制达到调控适应性炎症反应[6]。

本研究结果显示，HBV相关性肝病患者PBMCs表面Tim-3的表达水平与HBV DNA载量呈负相关，与ALT、AST表达水平呈正相关，HBV相关性肝病患者PBMCs表面PD-1的表达水平与HBV DNA载量呈负相关，与ALT、AST表达水平均呈正相关。与王琳等[1]研究结果相似。安仲武等[10]的研究结果中显示，在ALT＞2×ULN，Tim-3表达水平升高，提示机体免疫细胞分泌的促炎因子可能处于较高的表达水平，PBMCs诱导分泌的促炎因子Tim-3、PD-1的表达水平也增加，表明Tim-3、PD-1参与诱导、促进HBV相关性肝病患者炎症反应过程所致的肝细胞损伤。

本研究资料结果显示，健康对照组外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平最低，与HBV携带组比较差异无统计学意义，随着病情加重，其PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平逐渐升高，在重型乙型肝炎组、肝细胞癌组水平最高，各HBV相关性肝病患者组PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平与健康对照组、HBV携带组比较差异有统计学意义。表明Tim-3、PD-1高表达与机体感染HBV后的炎症和纤维化程度相关，且PBMCs表面Tim-3、PD-1的表达水平与HBV相关性肝病患者病情程度呈正相关，提示Tim-3、PD-1参与肝组织炎症的发生、发展过程，表明CHB患者外周单核细胞Tim-3上调可能参与HBV感染慢性化过程，可为HBV感染患者的免疫治疗提供一定理论基础，这与其他学者研究结果相似[11]。NEBBIA等[12]实验结果提示，阻断PD-1通路可减轻肝组织炎症程度和阻止肝组织肝纤维化的发生，在阻断Tim-3/天然配体半乳糖凝素-9通路后，可对增强HBV特异性T淋巴细胞免疫应答反应起到明显调控作用，表明Tim-3、PD-1两条信号通路对机体的免疫抑制具有协同作用。本研究发现，HBV相关性肝病患者PBMCs表面Tim-3与PD-1表达水平呈正相关，提示负性共刺激因子Tim-3和负向的协同共刺激分子PD-1间具有高度的协同性，可相互协同促进、参与HBV感染后相关性肝病患者体内的炎症反应的发生与免疫逃逸过程，同时增强机体的免疫耐受能力。

本研究发现，HBV相关性肝病患者PBMCs表面Tim-3表达水平与HBV DNA载量呈负相关，PD-1表达水平与HBV DNA载量也呈负相关。这与赵小瑜等[11]研究结果相似，提示CHB患者Tim-3表达水平与HBV DNA载量呈负相关，PD-1的表达水平与血清HBV DNA载量呈负相关，但差异无统计学意义。NEBBIA[12]在对18例接受抗乙肝病毒治疗的CHB患者研究发现，PD-1表达水平与HBV DNA载量呈正相关，在抗病毒治疗后患者外周血PD-1水平下降明显。同时PENG等[13]研究发现，CHB患者HBV特异性CD8+T淋巴细胞表面PD-1水平与HBV DNA载量呈正相关。本研究结果提示，HBV相关性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平高低与HBV DNA载量呈负相关，表明Tim-3、PD-1表达水平可能会影响HBV DNA的复制，笔者认为，通过调节Tim-3、PD-1表达水平可能会对HBV相关性肝病患者肝组织的炎症程度有一定调控作用，甚至也可能对HBV DNA水平或肝组织纤维化发生有一定调控作用。

综上所述，HBV相关性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表达水平具有差异，其表达水平变化与病情进展关系密切，PBMCs表面Tim-3、PD-1高表达可能会降低免疫细胞的免疫状态，诱发免疫耐受，从而使病情呈慢性化发展，在干预Tim-3、PD-1作用靶点后的肝组织炎症与纤维化程度改变如何，尚需进一步研究证实，这为HBV相关性肝病患者临床免疫治疗提供了一种新思路。