时秀云 于欣 马苏琳

人乳头瘤病毒(human papilloma virus， HPV)是以人类为唯一宿主的一种DNA 病毒， 现在已经明确， HPV 与宫颈癌的发生高度相关［1］。据统计， 60%～70%的女性感染过HPV 病毒， 99.8%的宫颈癌患者中可以检测到HPV， 而HPV 阴性者几乎不会发生宫颈癌。有15 种与宫颈癌相关的高危型HPV，其中我国高危病毒种组有HPV16、18、58 等［2］。目前， 分子生物学技术是临床检测HPV 的主要方法。第二代杂交俘获试验(hybrid capture test-Ⅱ， HC-Ⅱ)为临床近年来广泛采用的检查技术［3］。随着分子医学的不断发展， PCR 检验技术开始逐渐广泛应用于临床中， 实时荧光定量PCR 检测技术是将荧光标志技术与PCR 技术相结合， 在对HPV-DNA 的检测中具有灵敏性高、特异性强等优点［4］。本研究对实时荧光定量PCR 与HC-Ⅱ检测在高危型HPV 中的诊断价值进行比较，以评价实时荧光定量PCR 检验在高危型HPV 诊断中的应用价值。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院妇产科2016 年3 月～2019 年3 月收治的224 例高危型HPV 感染患者为研究对象， 年龄26～58 岁， 平均年龄(34.33±8.52)岁。且签署知情同意书。

1. 2 方法 患者均分别进行实时荧光定量PCR 与HC-Ⅱ检测。

1. 2. 1 实时荧光定量PCR 检验 ①收集宫颈脱落细胞标本：扩阴器暴露宫颈口， 用棉拭子将分泌物擦去， 将宫颈刷伸入宫颈口， 单向轻柔转动4～5 周， 将其放入有保存液的洗脱管中， 旋紧管盖， 做好标识， 将宫颈刷折断， 刷头留在管中。②提取HPV-DNA：将标本转移到1.5 ml 微量离心管中，13000 r/min 离心10 min， 弃上清， 加50 μl 裂解液充分悬浮沉淀， 100℃加热10 min， 13000 r/min 离心10 min， 保留上清待用。③PCR 扩增：50℃ 15 min， 95℃ 10 min， 进行40 个55～95℃循环， 加热模板DNA 至95℃， 双链DNA 解离成为单链。

④杂交与洗脱：PCR 产物加入杂交缓冲液中， 沸水浴变性10 min， 设定杂交仪的温度， 于51℃杂交1 h， 51℃洗脱15 min。⑤显色与结果判读：POD 孵育， POD 洗涤， 配制显色液， 显色。

1. 2. 2 HC-Ⅱ检测 采用Digene公司提供的HPV-DNA检测试剂盒， 对细胞标本双链解链处理， 后使用RNA 探针进行杂交， 生成的杂交体与特异性抗体相结合， 根据发光的强度与大小进行定量测定， 计算其含量。若HPV 负荷量≥1.0 pg/ml，可判定HPV 阳性。

1. 3 观察指标 比较不同程度宫颈病变患者HPV 检出情况比较；比较两种检测方法的HPV 阳性检出率和符合率。

1. 4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。一致性评估采用Kappa 检验, 以0.4＜Kappa 值≤1 为一致性好。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 不同程度宫颈病变患者HPV 检出情况比较 224 例高危型HPV 感染患者中， 76 例患者存在不同程度的CIN， 其中CIN Ⅰ级41 例， CIN Ⅱ级23 例， CIN Ⅲ级12 例。72 例患者为鳞状上皮病变和慢性宫颈炎；CIN 各期患者的实时荧光定量PCR HPV 检出率与HC-Ⅱ HPV 检出率比较， 差异均无统计学意义(P＞0.05)；鳞状上皮病变和慢性宫颈炎患者的实时荧光定量PCR HPV 检出率为62.5%， 高于HC-Ⅱ的33.3%，差异具有统计学意义 (P＜0.05)。见表 1。

2. 2 两种检测方法的HPV 阳性检出率比较及一致性分析 实时荧光定量PCR 检测的HPV 阳性检出例数为169 例、检出率为75.4%， HC-Ⅱ检测的HPV 阳性检出例数为141 例、检出率为62.9%。实时荧光定量PCR 检测的HPV 阳性检出率高于HC-Ⅱ检测， 差异具有统计学意义(χ2=8.210， P＜0.05)。两种检测方法的符合率为83.0%(186/224)， 一致性检验结果显示， 两种检测方法的Kappa 值为0.67， 提示虽然阳性检出率存在差异， 但两种检测方法仍具有较高的一致性。见表2。

表1 不同程度宫颈病变患者HPV 检出情况比较［n(%)］

表2 224 例患者采用两种检测方法的HPV 阳性检出情况及符合情况(n, %)

3 讨论

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一， 占女性生殖器官恶性肿瘤的50%以上， 严重威胁着妇女的健康。全世界每年大约有4 万人患病， 中国新发病例约计13 万， 是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要原因［5］。有研究证明， 99%的宫颈癌组织中可检出HPV， 随着病变程度的加重，HPV 的检出率也逐渐增高， 因此目前已经明确HPV 感染为宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件［6］。有研究表明， 高危型HPV 感染与宫颈癌关系最为密切。宫颈癌在发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期， 是唯一一种能够通过医学干预降低发病率和死亡率的恶性肿瘤［7］。如能进行HPV 早期检测， 并在癌前病变阶段进行阻断性治疗， 其治愈率可达98%， 而一旦疾病发展成癌症并扩散至其他器官， 则其5 年存活率只有20%［8］。因此高危型HPV 的临床诊断对于宫颈癌的预防和治疗具有重要意义。研究发现， 造成宫颈癌及其癌前病变的高风险HPV 亚型共有14 种， 其中HPV16和HPV18 风险最高， 可导致70%～85%的宫颈癌病例［9］。通过宫颈病变及宫颈癌的筛查， 经分型检测对患者个体化评估，预测宫颈病变发生的风险度， 来决定筛查时间的间隔及治疗方案的制定。

由于HPV 至今尚不能在体外培养， 又无合适的实验动物， 因而对其检测主要依赖于分子生物学技术和形态学方法［3］。目前HPV 检测方法主要包括有细胞学法、杂交捕获法、PCR 法、Southern 杂交法、荧光原位杂交法、斑点印迹法等［10］。HC-Ⅱ系第二代杂交俘获试验， 相比于第一代杂交俘获试验(hybrid capture test-Ⅰ， HC-Ⅰ)， 将由原先的试管法改为96 孔平板法， 提高了工作效率， 降低了成本， 更适于大人群的筛查。该法同时能检测13 种高危型HPV， 已得到世界范围的认可［11］。Petry 等［12］对德国8466 例患者进行HC-Ⅱ检测结果发现， HC-Ⅱ检测CINⅡ级的敏感性97.8%高于常规细胞学的43.5%， 而且HC-Ⅱ检测CIN Ⅱ级的特异性为95.3%， 阴性预测值为100.00%， 阳性预测值为10.9%， 基本吻合细胞学检测。但HC 检测也有一定的局限性：①不能区分HPV 具体型别；②如果所得相对光单位值接近或者＜1.0，则不能确定HPV 感染；③标本采集及保存有特殊的要求， 必须应用Digene 公司提供的专用器材及试剂， 或者应用液基细胞学剩余标本；④检测结果阴性并不能排除HPV 感染， 因为可能存在病毒感染水平很低或者采样不正确导致的假阴性；⑤HC-Ⅱ存在交叉杂交的问题， 即与不在混合探针中的其他HPV 型起交叉反应引起假阳性结果而降低特异性。

目前HPV 最灵敏的检测方法是以基因扩增为基础检测HPV-DNA， 可检测出低水平的病毒感染， 并且能够比较准确地检测出HPV 感染状态， 因此成为流行病学和实验室研究的常用方法［13］。实时荧光定量PCR 技术是一种新型核酸定量检测方法， 是由美国Perkin Flmer 公司于1995 年研制成功的，是在DNA 扩增反应中， 以荧光化学物质测每次PCR 循环后产物总量的方法。其检测原理为将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA 混合后， 完成高温变性， 低温复性， 适温延伸的热循环， 并遵守聚合酶链反应规律， 与模板DNA 互补配对的Taqman 探针被切断， 荧光素游离于反应体系中， 在特定光激发下发出荧光， 随着循环次数的增加， 被扩增的目的基因片段呈指数规律增长， 通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度， 求得Ct 值， 同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照， 即可得出待测标本目的基因的拷贝数。该法将普通PCR 的高灵敏性、DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确性有机结合， 克服了传统PCR 在许多方面的缺点和局限性。由于荧光探针的引入， 而且被释放的荧光基团数目与PCR 产物数量相同， 使得该方法对DNA 模板定量的准确性与特异性都有很大提高。常用的PCR 扩增仪与传统PCR 扩增仪相比， 应用更广泛、检测效率高、定量测量、结果重复性好、无管道内污染、扩增产物无需电泳分析等特点。荧光 PCR 检测差异性微小， 检验结果的相关性较为良好。

本研究结果显示：224 例高危型HPV 感染患者中， 76 例患者存在不同程度的CIN， 其中CIN Ⅰ级41 例， CIN Ⅱ级23 例， CIN Ⅲ级12 例；72 例患者为鳞状上皮病变和慢性宫颈炎。CIN 各期患者的实时荧光定量PCR HPV 检出率与HC-Ⅱ HPV 检出率比较， 差异均无统计学意义(P＞0.05)；鳞状上皮病变和慢性宫颈炎患者的实时荧光定量PCR HPV检出率为62.5%， 高于HC-Ⅱ的33.3%， 差异具有统计学意义(P＜0.05)。实时荧光定量PCR 检测的HPV 阳性检出率为75.4%， HC-Ⅱ检测的HPV 阳性检出率为62.9%， 实时荧光定量PCR 检测的HPV 阳性检出率高于HC-Ⅱ检测， 差异具有统计学意义(χ2=8.210， P＜0.05)。两种检测方法的符合率为83.0%(186/224)， 一致性检验结果显示， 两种检测方法的Kappa值为0.67， 提示虽然阳性检出率存在差异， 但两种检测方法仍具有较高的一致性。提示实时荧光定量PCR 检测技术检测HPV 相比于HC-Ⅱ检测具有更高的准确度。

综上所述， 实时荧光定量PCR 检测高危型HPV 具有较高的敏感性和特异性， 诊断价值高， 在实验条件允许的情况下， 可做为首选的HPV 检验方法加以推广和应用。