陈汉泽，田力，滕伟禹

（中国医科大学1.附属第一医院神经内科，沈阳 110001；2.附属盛京医院老年病科，沈阳 110004）

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是临床常见的急重症之一，占全部卒中的10%～15%［1］。其高致死率和致残率给患者带来了极大灾难。最新调查研究［2］显示近年来ICH患者死亡率有所下降，但是致残率却有升高趋势。组织蛋白酶L（cathepsin L，Cat L）是一种广泛存在的嗜酸性溶酶体蛋白水解酶。主要分布于溶酶体中，在细胞核、细胞质和细胞外基质中也有分布［3］。Cat L 主要参与蛋白质降解，在维持细胞内蛋白平衡方面起重要作用，与多种病理生理过程（自噬、凋亡、神经递质加工等［4-5］）有关。最近，研究发现Cat L 参与多种神经系统疾病（痴呆［6］、帕金森病［7］、脑梗死［8］等）。本研究拟建立实验性ICH大鼠模型，检测大鼠脑组织中Cat L表达，探讨Cat L在ICH中的作用及病理意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性SPF级Wistar大鼠135只，体质量250～280 g，由中国医科大学实验动物部提供。大鼠随机分为3组：Z-FY-CHO组［45只，ICH大鼠模型建立后侧脑室注射Cat L选择性抑制剂Z-FY-CHO溶液（美国Sigma公司，2 μL，1 μg/μL）］，ICH组（45只，ICH大鼠模型建立后侧脑室注射2 μL 10%DMSO溶液），假手术组（45只，基底节注射100 μL生理盐水）。在造模后1、3、7、14 d，各组中随机选取5只大鼠进行神经功能评估以及脑含水量检测；5只大鼠进行血脑屏障通透性检测。

1.2 ICH大鼠模型制备及给药

采用自体血模型构建ICH大鼠模型。大鼠用麻醉机麻醉后，取仰卧位固定，消毒后切开腹股沟皮肤暴露股动脉，用微量注射器抽取100 μL动脉血。止血后，迅速装上耳杆，固定于立体定位仪上。将石蜡油涂在大鼠眼球上，剪去大鼠头颅顶部毛发切开皮肤，3%双氧水涂于大鼠颅骨表面，暴露出前囟位置。在大鼠前囟右侧3.5 mm、前方0.5 mm处用手电钻轻轻钻开颅骨，将微量注射器固定于相应位置缓缓插入，深度5.0 mm，停留2 min，继续插入0.5 mm，停留5 min，随后将50 μL血液注入（10 μL/min），停留5 min后再将剩余50 μL血液以相同速度注入鼠脑中。停留20 min后将注射器缓缓拔出，缝合大鼠皮肤，待大鼠恢复意识后，将其送回鼠笼，给予充足食物和水并单独饲养。假手术组在相同条件下，注射相同体积的生理盐水。Z-FY-CHO组于造模后2 h，侧脑室注射Z-FY-CHO溶液（2 μL/只，1 μg/μL，10% DMSO溶液），ICH组造模后2 h侧脑室注射10%DMSO溶液2 μL/只。

1.3 实时PCR检测

实时 PCR试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司，所需引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。定量PCR所用引物及探针序列见表1。术后第3天将大鼠麻醉后取脑，通过 Taqman探针法，以GAPDH为内参。将构建的重组质粒DNA作为标准品，以质粒的初始模板绝对量对数为横坐标、以Ct值为纵坐标建立标准曲线。以Cat L/GAPDH初始模板量代表每个标本Cat LmRNA表达水平的相对量。每个标本检测3次，结果取平均值。分别提取假手术组、ICH组、Z-FY-CHO组脑组织的cDNA，与质粒标准品进行实时PCR，通过标准曲线计算Cat L与GAPDH的初始模板量比值。

表1 RT-PCR所需引物及探针序列Tab.1 Primers and probe sequences for real-time quantitative polymerase chain reaction testing

1.4 行为学测定

利用神经功能评分表［9］对大鼠进行神经功能评估。评估内容包括对称性、步态、攀爬、旋转行为、前肢对称性、强制转圈、胡须反应。每项分为0～4分5个等级，最高得分为28分。

1.5 脑含水量测定

大鼠麻醉后迅速断头取脑，去除嗅球和小脑后将大脑分成左右两半球，取出血一侧半球，称量其湿质量后，置于100 ℃烘箱中24 h，称量其干质量，脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.6 血脑屏障通透性测定

大鼠处死前1 h静脉注射2%依文思蓝（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，4 mL/kg），处死后立即心脏灌注肝素化生理盐水，将出血一侧大脑半球浸入甲酰胺（3 mL/100 mg），60 ℃孵育24 h，15 000g离心30 min，在610 nm处测上清吸光度，做出标准曲线，计算依文思蓝含量。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织中Cat L mRNA表达水平

结果显示，假手术组、ICH 组、Z-FY-CHO组脑组织中Cat LmRNA相对表达量分别为1.00±0.00、5.00±0.51、2.43±0.26。与假手术组比较，ICH组、ZFY-CHO组脑组织中Cat LmRNA表达明显增高（P＜0.05）；与ICH组比较，Z-FY-CHO组脑组织中Cat LmRNA表达明显降低（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠神经功能评分比较

结果显示，与假手术组比较，ICH组大鼠在造模后1、3、7、14 d时神经功能评分均明显升高（P＜0.05）。与ICH组比较，Z-FY-CHO组在3 d时神经功能评分明显降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠神经功能评分及脑组织含水量比较Tab.2 Neurologic impairment scores and brain water content of the different groups

2.3 各组大鼠脑组织含水量比较

结果显示，与假手术组比较，ICH组在造模后1、3、7 d时大鼠脑含水量明显升高（P＜0.05）。与ICH组比较，Z-FY-CHO组在造模后1、3 d时大鼠脑含水量明显降低（P＜0.05），见表2。

2.4 各组大鼠血脑屏障通透性比较

结果显示，与假手术组比较，ICH组在造模后1、3、7、14 d时大鼠脑组织依文思蓝含量均明显升高（P＜0.05）。与ICH组比较，造模后1、3 d时Z-FY-CHO组大鼠脑组织依文思蓝含量明显降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠血脑屏障通透性比较Tab.3 Eveas blue content in the brains of the different groups

3 讨论

研究发现，Cat L在神经组织中有较高表达，且在脑梗死后，梗死区域周围微血管、邻胶质细胞和神经元中Cat L 的表达明显升高［8］，而抑制Cat L 的表达可以促进脑梗死大鼠神经功能恢复［10］。本研究结果显示，在ICH大鼠脑组织中Cat LmRNA表达量明显升高，Z-FY-CHO抑制Cat LmRNA表达，因此Z-FY-CHO可以有效促进神经功能恢复，减轻脑水肿，减轻血脑屏障破坏程度，提示Cat L在ICH疾病进程中发挥至关重要的作用。

ICH后进入脑组织中的血肿主要由红细胞、凝血因子、免疫球蛋白和补体等构成。研究［11］发现，这些成分均可以通过小胶质细胞表面受体激活小胶质细胞，激活的小胶质细胞释放大量炎性细胞因子，扩大炎症反应，引起周围细胞死亡，而死亡的细胞释放的一系列危险相关模式分子又可以反过来激活更多的小胶质细胞［12］，形成的恶性循环不断加重脑组织损伤。除此之外，Cat L在小胶质细胞的激活过程中发挥重要作用［13］，研究发现小胶质细胞是Cat L的重要来源，小胶质细胞接受脂多糖处理后，迅速释放大量Cat L，释放出的Cat L降解细胞外基质，从而导致细胞死亡，而Cat L释放要早于一系列炎性细胞因子（iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、NO等），说明Cat L可能起到促进炎症反应的作用［14］。XU等［13］研究发现不管是动物还是细胞实验，抑制Cat L都可以有效减少小胶质细胞释放炎性细胞因子，从而减轻炎症反应，抑制Cat L还可以减少caspase-8激活，从而减轻凋亡反应。Cat L还可以将促凋亡蛋白Bid剪切成为tBid，继而使线粒体释放细胞色素C，激活caspase级联反应，导致细胞凋亡［13］。血脑屏障是位于血液和脑组织之间的一层选择性界面，主要由脑微血管内皮细胞、紧密连接、基底膜、周细胞和星型胶质细胞终足构成，而激活小胶质细胞释放出的Cat L 可以破坏这些结构，从而破坏血脑屏障，加重神经损伤［15］。

本研究通过注射自体血建立ICH大鼠模型，结果显示Z-FY-CHO可以有效抑制Cat L表达，并且随着Cat L表达降低大鼠神经功能恢复加快，脑含水量也明显降低。分析其原因可能是Cat L参与出血后炎症和凋亡反应，抑制Cat L表达减轻了炎症反应，减少了细胞凋亡，减轻血脑屏障破坏程度，从而导致大鼠神经损伤减轻。

综上所述，实验性ICH大鼠脑组织中Cat L表达上调，Cat L抑制剂Z-FY-CHO能够抑制Cat L表达，降低脑含水量，减轻血脑屏障破坏，减轻神经损伤程度。Cat L参与了ICH后神经损伤过程，Cat L抑制剂可能成为ICH治疗的新方向，而Cat L在ICH进程中的具体作用机制还需要进一步研究。