张丽红 ，郭敏芳，张慧宇，章培军，邢雁霞，马存根，薛慧清，赵海宝

（1.山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009；2.山西中医药大学基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室，太原 030619；3.大同市第三人民医院病理科，山西 大同 037008）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种T细胞介导的主要累及中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质的特异性炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病，具有高致残、高复发的特点。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE）是国际上公认的研究 MS 的理想动物模型。MS和EAE的基本病理过程相似，外周髓鞘抗原特异性T细胞通过分子模拟机制被初次激活，穿过血脑屏障（blood brain barrier，BBB）进入CNS，之后被再次激活，释放各种有害物质并诱发一系列瀑布样异常免疫应答反应。近年来，我国MS的发病率呈不断上升趋势。西药治疗MS效果差，不良反应大，因此有不少学者致力于从中草药中寻找有效的成分，积极探索寻找新的治疗药物。黄芪为豆科多年生草本植物的干燥根，具有补中益气之功效，作为一种具有较强免疫调节作用的中药，广泛应用于免疫性疾病的临床治疗［1-2］。黄芪糖蛋白（Huangqi glycoprotein，HQGP）是从中药黄芪中提取纯化的一种天然植物糖蛋白，本课题组的前期研究［3-4］发现HQGP对EAE 小鼠有一定的抗炎作用，因此推测其对EAE的BBB可能具有保护作用，并可能是抑制炎症细胞入侵，减轻临床症状的重要原因。因此，本研究拟探讨HQGP对EAE小鼠BBB通透性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选取健康清洁级雌性C57BL/6小鼠40只，8～10周龄，体质量18～22 g，于标准动物饲养室内饲养1周后制造EAE模型，所有动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.1.2 主要试剂：小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG 35-55）购自西安联美生物科技有限公司；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）由瑞士Alexis公司提供；结核分支杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）购自美 国BD公 司；完 全Freund佐 剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）、兔抗小鼠CD4和CD68单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）购自英国AbD Serotec公司；Alexa Fluor 555 标记的山羊抗兔二抗购自美国Invitrogen公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 EAE小鼠模型制备：随机将C57BL/6雌性小鼠分为EAE组和HQGP组，每组20只。MOG35-55的配制与注射均严格参照文献［5］进行，免疫当天记为免 疫 后0 d（the 0 day post-immunization，d0 p.i.），2组小鼠于d0 p.i.和d2 p.i.均给予腹腔注射PTX增强免疫2次（500 ng/只）。HQGP组在d3 p.i.开始腹腔注射HQGP ［1 mg/（kg·d）］，持续给药15 d。

1.2.2 状态观察与评分：每天由2人对各组小鼠的一般状态进行观察，并对运动功能进行评分，观察内容包括饮水、摄食、毛发色泽、体质量、运动功能、发病情况等，记录测量结果。运动功能评分标准采用国际通用的5分法［6］，计算平均起病时间（组内每只动物首发症状天数的均值）和平均高峰评分（组内每只动物最高评分的均值）。

1.2.3 脑组织含水量的测定：免疫后第18天，每组各取5只小鼠，快速断头，在冰盒中完整剥离脑组织并称质量（脑组织湿质量），再将脑组织放入52 ℃电热恒温箱烘烤72 h，再称质量（脑组织干质量）。计算脑组织含水量=（脑组织湿质量-脑组织干质量）/脑组织湿质量。

1.2.4 BBB通透性的检测：免疫后第18天，每组各取5只小鼠，末次给药1 h后，尾静脉注射2%伊文思蓝（evans blue，EB）100 μL/只。以小鼠的眼结膜、四肢、全身皮肤出现明显蓝染为注射成功，100 g/L水合氯醛麻醉后行生理盐水灌流，冰盒中迅速剥离脑组织，称质量并记录脑组织湿质量。然后加甲酰胺溶液浸泡，45 ℃避光孵育72 h，充分匀浆后，15 000 r/min离心20 min。在酶标仪上630 nm处测定上清液吸光度值（A）。根据EB标准曲线求出 EB含量，用EB浓度（μg·mL-1）/脑湿质量（μg·g-1）表示。

1.2.5 病理标本采集及处理：免疫后第18天，每组各取5只小鼠，100 g/L水合氯醛麻醉后行4%多聚甲醛灌流，分离脊髓组织，用冰冻切片包埋剂（optimal cutting temperature compound，OCT）包埋，置液氮蒸汽中凝固后，迅速放入-80 ℃冰箱冻存。制作冰冻切片，厚度10 μm，然后行免疫荧光染色。

1.2.5.1 HE染色 于水中浸泡脊髓冰冻切片2 min，苏木精染色10 min，水洗1 min，5%盐酸乙醇分化15 s，伊红染色30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，甘油封片后，显微镜下观察炎症细胞浸润情况。

1.2.5.2 LFB髓鞘染色 95%乙醇浸泡取脊髓冰冻切片3 min，固蓝液中57 ℃孵育24 h，去离子水浸洗3 min，95%乙醇浸洗3 min，0.05%碳酸锂溶液浸泡15 s，70%乙醇分化至灰白质清晰可辨，去离子水迅速冲洗3 min，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察髓鞘脱失情况。使用Image Pro Plus软件计算小鼠髓鞘脱失面积与白质面积比值。

1.2.6 免疫荧光染色：取脊髓冰冻切片，室温晾干，PBS洗5 min×3次，10 g/L BSA-PBS室温封闭1.5 h后，分别加入1 ∶1 000稀释的兔抗小鼠CD4和CD68抗体，4 ℃过夜；次日于室温下再用PBS洗5 min×3次，滤纸吸干，加入Alexa Fluor 555 标记的山羊抗兔二抗，室温下孵育2 h，PBS洗5 min×3次，50%甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。使用Image Pro Plus软件统计每个完整切面的炎症细胞数量，比较2组每个完整切面CD4+和CD68+细胞数，分析炎症细胞浸润情况。

1.2.7 Western blotting检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达：脊髓组织提取蛋白定量后，加入5×上样Buffer，用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入1 ∶1 000稀释的兔抗小鼠Occludin、ZO-1和GADPH一抗，4 ℃过夜；次日TBST洗涤后，加入1 ∶5 000稀释的HRP标记的二抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗涤后进行化学发光反应，用Bio-RAD凝胶成像仪分析条带，用Band Scan分析2组Occludin和ZO-1的灰度值与内参GAPDH的灰度值比值，并进行统计学分析。

1.3 统计学分析

采用统计分析软件GraphPad Prism 5.0进行统计分析处理，2组间实验数据的比较采用Student-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HQGP对EAE小鼠症状和病变的影响

与前期研究［7］结果一致，与EAE模型组比较，HQGP治疗可减轻EAE症状，延缓发病。病理结果显示，HQGP治疗可显著降低炎症细胞向脊髓组织浸润，降低髓鞘脱失面积。

2.2 脑组织含水量及BBB通透性检测结果

免疫后18 d，HQGP组小鼠脑内水、EB含量均低于EAE组（P＜0.05，P＜0.01）。见图1和表1。

图1 EAE和HQGP组小鼠脑组织水和EB含量比较Fig.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups

表1 2组小鼠脑组织含水量和EB含量比较（，n=5）Tab.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups（，n=5）

表1 2组小鼠脑组织含水量和EB含量比较（，n=5）Tab.1 Comparison of water and EB content in brain tissue between the EAE and HQGP groups（，n=5）

1）P＜0.05；2）P＜0.01 vs EAE group.

2.3 2组小鼠脊髓炎症细胞浸润情况

2组脊髓腰骶段横断面冰冻切片免疫荧光染色显示，CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞主要在脊髓白质区表达，且EAE组CD4+T细胞数（114.3±11.84）高于HQGP组（46.0±6.72），差异有统计学意义（P＜0.001），提示HQGP能明显减轻CD4+T细胞向脊髓的浸润；EAE组CD68+巨噬细胞数（102.70±12.26）显著高于HQGP组（35.33±13.08），差异有统计学意义（P＜0.001），提示HQGP能明显减少CD68+巨噬细胞浸润数量。见图2。

2.4 2组小鼠紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达情况

图2 2组小鼠脊髓CD4+和CD68+细胞浸润情况比较Fig.2 Comparison of CD4+ and CD68+ cell infiltration in spinal cords of EAE and HQGP groups

Western blotting结果显示，HQGP组小鼠脊髓内细胞紧密连接蛋白Occludin表达水平（2.01±0.14）较EAE组（0.94±0.07）增高，HQGP组小鼠脊髓内细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达水平（2.37±0.20）较EAE组（0.964±0.14）增加，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。见图3。

图3 2组小鼠脊髓内Occludin和ZO-1蛋白表达水平比较Fig.3 Comparison of Occludin and ZO-1 protein expression in spinal cords of EAE and HQGP groups

3 讨论

MS及其EAE动物模型广泛用于涉及T细胞介导的炎症性疾病的研究，其特征为淋巴细胞浸润、脱髓鞘和轴突损伤［8］。BBB功能障碍是EAE和MS进展的主要特征之一，炎性细胞因子通过受损的BBB迁移至大脑，导致脑水肿、脱髓鞘和神经细胞死亡［9］。传统中医药可用于治疗复杂多变的MS，不良反应少［10］。HQGP是一种从黄芪中提取的有效成分，对MS/EAE中的神经保护和免疫调节有积极作用［11］。本研究探讨了HQGP对EAE小鼠瘫痪症状的潜在保护作用，结果表明HQGP延迟了EAE的发作，改善了EAE的严重程度，且HQGP对EAE的治疗作用至少有一部分是通过强化BBB完整性及抗炎作用介导的。

在EAE的复杂过程中，涉及免疫系统的各种细胞，包 括CD4+Th1和Th17，γδT细 胞，CD8+T细 胞，Treg细胞和巨噬细胞［12］。CNS的炎症浸润主要是由活化的T细胞和巨噬细胞组成［13］。这也说明MS病程中BBB破坏，从而使循环血液中炎症细胞穿过BBB浸润至CNS。免疫荧光标记表明，HQGP处理后，浸润的CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞数显著减少。证明HQGP可抑制免疫细胞向脊髓的浸润，从而有助于改善脊髓的炎症微环境，从而提高EAE临床评分。

EB染料广泛用于检测BBB渗漏，因为它与血清白蛋白结合形成大分子复合物，在正常生理环境下不能穿过完整的BBB。因此，本研究将EB染料进入大脑的量作为BBB渗透性的指标。结果表明，与EAE小鼠相比，HQGP处理显著降低了脑中EB的含量。说明HQGP能防止EAE小鼠模型BBB的破坏。

内皮细胞间紧密连接（tight junction，TJ）由大的多蛋白复合物组成，是构成BBB的主要成分之一，紧密连接蛋白主要由跨膜蛋白Occludin、claudins和胞质蛋白ZO-1组成。Occludin的作用是连接跨膜蛋白和细胞骨架，影响肌动蛋白的收缩性，影响TJ的功能，从而使BBB的通透性明显低于其他屏障性结构［14］。有研究［15］认为Occludin表达水平可以表明BBB的结构功能状态，其下降程度可以作为BBB损伤程度的标志。而ZO-1是与TJ相关的主要细胞质蛋白。其作用是将Occludin和claudins的COOH末端连接到潜在的肌动蛋白细胞骨架，据文献［16］报道，ZO-1或Occludin表达的减少能导致BBB通透性增加。本研究结果显示，HQGP治疗可使EAE小鼠脊髓组织内Occludin和ZO-1的表达增加，表明HQGP能有效地防止EAE模型小鼠中BBB的破坏，促进BBB功能的修复。

总之，本研究表明HQGP可以抑制EAE小鼠CNS炎症细胞浸润，改善脱髓鞘程度，促进BBB损伤修复，具体机制可能与上调紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达，抑制炎症细胞向CNS迁移有关。