谢泰祥，姚荣荣，陈 娟，陈 璐，艾 叶

(1.福建农林大学园林学院，福建 福州 350002；2.兰科植物保护与利用国家林业与草原局重点实验室，福建 福州350002；3.福建农林大学金山学院，福建 福州 350002)

建兰Cymbidium ensifolium 作为中国传统八大类兰花之一，兼具叶艺、花艺和株艺等多方面的观赏价值[1]。叶艺是指兰花的叶片发生相对稳定的变异，包括叶片色彩和叶片形状的变化，可分为线艺、斑艺、水晶艺和叶蝶四大类[2]。据记载，最早的叶艺品种是从建兰中培育出来的，命名为‘加冶屋’[3]。‘八宝奇珍’C. ensifolium ‘Ba Bao Qi Zhen’是建兰天然变异品种，同时具备爪艺、曙斑艺、虎斑艺、缟艺等多种叶艺变化，艺色鲜艳亮丽，艺向混合变化，极具观赏价值，是建兰叶艺代表品种。

叶艺性状在国兰鉴赏中起着重要作用，因此其形成机制的研究对于指导人工诱变叶艺品种具有重要意义。蒋彧等[4]通过对比春剑‘隆昌素’C. tortisepalum var. longibracteaturn ‘Long Chang Su’的正常叶片和叶艺叶片的色素含量，发现叶艺叶片中叶绿素a 含量相对降低，而叶绿素b 含量增加，且类胡萝卜素含量相对较高。田韦韦等[5]发现文心兰Oncidium spp.叶艺叶片的叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量均比正常叶片显著降低，最大荧光(Maximum Fluorescence，Fm)、最大光化学效率(Maximum quantum yield of photochemistry，Fv/Fm)、PSⅡ有效光化学效率[Effective quantum yield of photosystem II (PSII)photochemistry，Fv′/Fm′]和 PSⅡ实际光化学效率[Practical quantum yield of photosystem II (PSII)photochemistry，ΦPSⅡ]均显著低于正常叶片，但初始荧光(Minimum Fluorescence，Fo)比正常叶片高，而稳态光适应光化学淬灭系数(Steady state light adaptation photochemical quenching coefficient，qP)和稳态非光化学淬灭系数(Steady state non-photochemical quenching coefficient，NPQ)与正常叶片无显著差异。目前，关于叶艺性状形成的机制仍然不清楚，已有的研究分析推测其形成的主要原因是由于基因突变、营养缺乏、病毒感染或真菌寄生等因素造成叶肉细胞缺乏光合色素，从而形成局部叶片细胞的黄化或白化[2,6—7]。

本研究以建兰‘八宝奇珍’为材料，测定了全绿、全黄、黄绿等3 种不同表型叶片的光合色素含量以及叶绿素荧光参数，以期为建兰叶艺性状形成的机制提供理论依据，同时对其他观叶植物叶色变异的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

建兰‘八宝奇珍’由福建农林大学森林兰苑苗圃提供，选择栽培多年、生长状况良好、无病虫害的植株(图1)。

1.2 方法

1.2.1 叶绿素测定 取全黄、全绿、黄绿叶片各3 片，切取叶尖处7 cm按照苏正淑等[8]改良的丙酮法测定叶绿素含量。将丙酮与无水乙醇按照1∶1 混合摇匀作为提取液，将采集叶片先用酒精擦拭干净，去除主脉后剪碎，准确称量0.0500 g，装入10 mL离心管中，用移液枪注入5 mL 提取液，黑暗条件下放置24 h 左右，期间不间断上下摇晃至叶子全部变白。取200 μL 上清液至酶标仪比色杯中，测定663 nm 和645 nm 吸光度条件下吸光值[9]。利用Arnon 丙酮法公式计算叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量。

叶绿素a 含量(mg·g)=(12.7D663-2.69D645)×V/1000；

叶绿素b 含量(mg·g-1)=(22.9D645-4.68A663)×V/1000；

总叶绿素含量(mg·g-1)=(20.2D645+8.02D663)×V/1000；

1.2.2 叶绿素荧光参数测定 采用捷克FluorCam 开放式叶绿素荧光仪对叶绿素荧光参数进行测定。选取生长良好、长势一致的全黄、全绿、黄绿叶片各3 片，从叶尖量取7 cm 放入暗室中处理20 min，然后开启Flashes 测量光，调整Shutter Sensitivity 使样品荧光值在500，选择Act2 后保证样品荧光值在500～1000 内，调节饱和光强，进行数据统计分析。参照Roháček[10]的方法及其定义，一次只完成一片叶片的数据测量，对不同表型叶片的初始荧光(Fo)、最大荧光产量(Fm)、Kautsky 诱导效应最大荧光(Fp)、最大光量子效率(Fv/Fm)、稳态光适应光化学淬灭系数(qP)、稳态非光化学荧光淬灭系数(NPQ)、光适应稳态荧光产量(Ft_Lss)等参数进行测量。各项数据测定均重复3 次，取平均值。

1.3 数据分析

利用Excel 2016 对数据进行整理，采用SPSS 24.0 软件对‘八宝奇珍’不同表型叶片的叶绿素含量及其叶绿素荧光参数进行单因素方差分析和LSD 法差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 叶绿素含量

从表1 可看出，叶艺品种不同表型叶片的叶绿素含量存在显著差异(P＜0.05)。全绿叶的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量显著高于黄绿叶和全黄叶，并且全绿叶片向黄化叶片过渡的过程中，随着黄化面积的增多叶绿素含量呈现逐渐递减的现象，说明叶片黄化变异的主要原因是叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量下降。对比3 种叶片叶绿素a/b 值，全黄叶片叶绿素a/b 与正常和黄绿叶片的叶绿素a/b 均存在显著差异，但正常绿叶与黄绿叶的叶绿素a/b 值差异不显著(P＞0.05)，由此推测叶片黄化变异的程度是由叶绿素含量及叶绿素a/b 比值共同决定的。

2.2 叶绿素荧光参数的差异

表1 建兰‘八宝奇珍’不同表型叶片的叶绿素含量Table 1 Photosynthetic pigments contents in different phenotype leaves of Cymbidium ensifolium ‘Ba Bao Qi Zhen’

测定‘八宝奇珍’ 3 种不同表型叶片的叶绿素荧光参数，全黄叶片和黄绿叶片的初始荧光量(Fo)、最大荧光产量(Fm)、Kautsky 诱导效应最大荧光(Fp)以及光适应稳态荧光产量(Ft_Lss)均显著低于全绿色叶片(P＜0.05)，且全黄叶片显著低于黄绿叶片(P＜0.05)(图2: A)。全黄、黄绿和全绿叶片的PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)无显著差异。不同程度的黄化叶片，黄绿与全黄之间的稳态非光化学荧光淬灭系数(NPQ)差异不显著，但均显著高于全绿叶片(P＜0.05)。全黄叶片的稳态光适应光化学淬灭系数(qP)显著低于全绿和黄绿叶片(P＜0.05)，但全绿与黄绿叶片之间差异不显著。由此推测，叶片的稳态光适应光化学淬灭系数(qP)可能受叶片黄化程度的影响(图2: B)。

正常全绿叶片Fo、Fm、Fp、Ft_Lss 以及qP 均高于黄化叶艺叶片，而NPQ 却最低(图2)。

3 结论与讨论

叶绿素是植物进行光合作用最重要的一类色素，排列于类囊体薄膜上，有吸收与转换光量子的能力，在光能的吸收和利用中起着至关重要的作用[11]。在光合作用中，叶绿素a 将吸收的光能转变为化学能进行光化学反应，叶绿素b 发挥着吸收和传递光能的作用[12]。植物体中叶绿素含量越高，越有利于阴生植物在弱光条件下有效吸收光能，同时叶绿素含量的变化会引起植物叶片颜色的改变[13]。叶艺是光合色素在植株叶片细胞中所占比例不同造成的，由此产生了由完全青绿色叶植株到具有颜色条纹的特异植株，甚至是整株全叶都具有多种颜色的色叶兰株[14]。Zhu 等[15]在研究墨兰Cymbidium sinense‘达摩’叶艺品种时发现，叶艺品种黄化的原因是有关叶绿素降解的关键酶基因表达较高，导致叶绿素含量过度降解，以至于叶绿素合成前体含量略有下降，从而在绿叶中出现叶艺的现象。本研究中建兰‘八宝奇珍’黄化变异叶片的总叶绿素含量、叶绿素a、叶绿素b 均随着黄化面积的增大而呈现逐渐递减的现象，全黄叶片的叶绿素含量显著低于全绿叶和黄绿叶，由此可以推测‘八宝奇珍’叶艺叶片的出现与叶片叶绿素含量的下降有关，这与范燕萍等[16]对墨兰花叶线艺兰的测定结果类似。

叶绿素荧光不仅直接反映植物叶片叶绿体间进行ATP 合成和CO2固定、光量子传递以及光电子梯度建立等过程，而且与植物叶片叶绿体的形成与发育程度相关，是反映植物叶片生理变异的探针[17—18]。研究表明，植物叶绿素含量与叶绿素荧光特性密切相关，其含量的变化往往伴随着叶片荧光特性的改变[19]。因此，叶绿素荧光技术被广泛应用到植物叶片生理变异研究中[15]。赵乐等[20]在对独行菜Lepidium apetalum 叶片的叶绿体编码蛋白LaSPS 基因的研究中发现，叶片的质体醌(Plastoquinone, PQ)影响着叶绿体的形成与发育，并以电子载体的形式参与电子从光系统传递到细胞色素b6f 复合体的过程，从而间接影响叶绿素荧光参数以及叶绿素含量。涂志华等[21]对沿海沙地10 个竹种的叶绿素荧光特性进行比较，发现正常绿叶竹子的初始荧光量(Fo)、最大荧光产量(Fm)均高于叶艺竹子，其主要原因是叶艺竹子在生长过程中受到更多的光抑制导致相应的叶绿素含量降低，从而影响植物的叶绿素荧光特性。刘宝等[22]在对21 个闽楠Phoebe bournei 种源叶片光合色素及叶绿素荧光参数分析中发现，叶绿素含量最高的种源，其PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm) 、稳态光适应光化学淬灭系数(qP)都大于其他种源。杜久军等[23]在对5 种榆树的快速荧光特性研究中发现，黑榆的Fo、Fm、qP 和Fv均显著高于其他表型的榆树，对应NPQ 最低。本研究中，建兰‘八宝奇珍’黄化变异叶片的初始荧光量(Fo)、最大荧光产量(Fm)、Kautsky 诱导效应最大荧光(Fp)以及光适应稳态荧光产量(Ft_Lss)均显著低于正常绿色叶片，同时，黄化变异叶片的叶绿素a、叶绿素b 以及总叶绿素含量都显著低于正常全绿叶片，表明叶绿素荧光特性伴随着叶绿素含量的降低而下降，与前人的研究结果一致。建兰‘八宝奇珍’黄化变异叶片的PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)与正常绿色叶片无明显差异，其原因可能是最大荧光产量(Fm)与叶绿素含量决定的初始荧光量(Fo)成正比关系，自身形成了一种适应性协调。黄化叶片的稳态非光化学荧光淬灭系数(NPQ)高于正常绿色叶片，可能是由于叶绿素含量较低，使得植物吸收的光能更多地以热量的形式散发出去，而不是转化为化学能进行储存和利用。正常全绿叶片的稳态光适应光化学淬灭系数(qP)最大，表明全绿叶片吸收的绝大部分能量用于光合作用，说明叶绿素含量与稳态光适应光化学淬灭系数qP 成正比关系。