陈诗宇，王利

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一种革兰氏阴性、需氧短杆菌，属于假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、假单胞菌属（Pseudomonas）[1]。恶臭假单胞菌是一种具有腐化作用的细菌，广泛分布于土壤及自然水体中[7]。恶臭假单胞菌为淡水鱼的一种致病菌，常从腐败的鱼中检出[2]，严重影响了水产养殖业的健康可持续发展[3]。恶臭假单胞菌可引起中华绒螯蟹爪无力[4]、杂交鲇皮肤褪色、溃烂[5]、大鲵死亡[6]、杂交鲟肠炎[7]及黑鲷腹水病[8]。恶臭假单胞菌也是一种人-禽-鱼共患的病原菌[7]，能够引起鸭[9]等禽类发病并且导致人食物中毒[10]。1998年，李庆山[10]等首次发现恶臭假单胞菌引起的食物中毒。鲫鱼（Carassius auratus）为常见淡水鱼，随着水产养殖的发展，鲫鱼逐渐受到许多病原菌的感染，其中恶臭假单胞菌的感染日趋严重。该试验从鲫鱼中分离得到菌株SY4，并进行了形态学观察、生理生化鉴定、16SrDNA基因分析以及药敏试验等研究。这为进一步研究恶臭假单胞菌特性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼样品

鲫鱼取自四川省成都市某养殖场，体长18 cm，体质量164 g。

1.2 主要仪器及试剂

显微镜购买自LEICA BME公司，恒温培养箱购买自上海齐欣科学仪器科技有限公司，PCR仪购买自Eppendorf Germany公司，生化鉴定药品、抗菌药物纸片均购买自杭州微生物试剂有限责任公司，电泳仪、凝胶成像系统均购买自BioRAD公司，TaqMix、DL2000 DNA Marker均购买自北京天根生化科技有限公司。

1.3 细菌分离

取鲫鱼肠道于MBS液体培养基（每1 000 mL MBS液体培养基由一水葡萄糖3.8 g、蛋白胨3.8 g、牛肉浸膏 3.8 g、淀粉 2.3 g、NaCl 3.3 g、KH2PO43.3g配成）中富集培养24 h，挑取培养的菌液，采用平板划线法均匀的划在MBS固体培养基（每1 000 mL MBS液体培养基添加20 g琼脂）上，37℃恒温培养24 h，纯化传代2～3次；挑取纯化后的单菌落于MBS液体培养基中，置于37℃摇床中培养24 h，挑取菌液进行革兰氏染色镜检。

1.4 生理生化鉴定

采用细菌微量生化鉴定管参照《伯杰士鉴定手册》[11]测定分离菌株SY4的生理生化特性。

1.5 16SrDNA基因扩增

用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）制备得模板DNA。应用16SrDNA通用引物，正向引物 F:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTTAG－3'，反向引物 R:5'－ ACGGCTACCTTGTTACGACTT－3'。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR反应体系(50μL):2×Taq PCR mix 25 μL，引物各 1 μL，模板DNA 5μL，超纯水 18μL。PCR反应条件：94℃ 预变性 5 min；94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统进行拍照，并将阳性样品送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行16 SrDNA基因测序。

1.6 系统进化树分析

将拼接序列提交至NCBI，同时利用Blast程序对分离菌株SY4进行16SrDNA序列相似性检索，找出相似性最高的菌种及同属菌株作为内群，另选其他菌种作外群。运用Clustalx 2.0软件进行多序列比对，再利用Mega 5.0软件，运用Neighbour-Joining方法，自举1 000次构建系统进化树。

1.7 药敏试验

采用标准Kirby-Bauer纸片扩散的方法，对分离菌株SY4进行诺氟沙星、庆大霉素等11种常用抗生素的敏感性检测，并根据美国临床实验室标准委员会（CLSI/NCCLS）执行标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

分离菌在MBS固体培养基上长出大小均一的菌落。可观察到黄色、光滑、不透明的菌落。革兰氏染色观察为革兰氏阴性菌，呈短棒状，如图1。

2.2 生理生化鉴定

图1 革兰氏染色形态图（400×）

经鉴定管反应测定了SY4菌株的理化特性，结果见表1，理化指标初步确定SY4菌株为恶臭假单胞菌。

表1 SY4的生理生化特征

2.3 16SrDNA基因扩增及分析

以菌株SY4 DNA为模板，采用16SrDNA通用引物进行PCR扩增，得到产物的长度约为1 500 bp（图2），实际测序结果为1 424 bp。将此序列提交至NCBI（登陆号：MH142393），用 Blast程序进行比对分析，得出SY4菌株与NCBI中的恶臭假单胞菌属的相似性最高。

图2 16SrDNA PCR扩增结果

2.4 16SrDNA序列系统进化树的构建

将菌株的16 SrDNA基因序列与NCBI中已有序列进行Blast比对，结果显示SY4菌株与假单胞菌属种类同源性高（99%）。选取同源性高的假单胞菌属的16 SrDNA基因序列，构建系统发育树（图3），结果显示SY4菌株与恶臭假单胞杆菌（P.putida）显著聚为一支。

图3 SY4菌株16SrDNA基因序列与相关菌株的系统发育树

2.5 药敏试验

药敏试验结果（表 2）显示：SY4菌株对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、诺氟沙星等4种抗生素高度敏感；对多粘霉素B、头孢曲松等2种抗生素中度敏感；对磺胺甲基异恶唑、氨苄西林、甲氧苄定、复方新诺明、舒巴坦等5种抗生素耐药。

3 讨论

该研究从鲫鱼中分离得到菌株SY4，通过对该菌的培养、形态学观察、生理生化分离鉴定初步判定该菌为恶臭假单胞菌。在生理生化鉴定阶段，杨圆圆等[7]对杂交鲟源恶臭假单胞菌的研究中，果糖显示为阳性，而SY4菌株的研究中，果糖显示为阴性；杨润德[12]等对丹顶鹤恶臭假单胞菌的研究中，枸橼酸盐显示为阳性，而SY4菌株的研究中，枸橼酸盐显示为阴性；在《伯杰氏系统细菌学手册》[11]中的模式菌株恶臭假单胞菌对枸橼酸盐、葡萄糖显示为阳性，吲哚反应显示为阴性，而SY4菌株对枸橼酸盐、葡萄糖显示为阴性，吲哚反应显示为阳性。造成这种差异的原因可能是菌株的来源以及试验的环境不同。因此，采用传统的生理生化鉴定方法进行菌的准确判定结果可能存在一定误差。该方法受菌株的来源、试验环境以及试验操作的影响，尤其对一些不常见菌、疑难菌的鉴定也可能比较薄弱[13]。鉴于此原因，该研究还采用了以16SrDNA为基础的细菌分离鉴定方法对SY4菌株的16S rDNA基因序列进行测序，经在NCBI中比对并构建系统发育树分析表明，分离菌株SY4与恶臭假单胞菌聚在一起。因此，结合传统的细菌鉴定方法和16SrDNA测序法综合判定SY4菌株是恶臭假单胞菌，从而提高了细菌鉴定的准确性。

表2 SY4菌株药敏试验结果

关于恶臭假单胞菌的耐药性目前仅有少量报道。毛之娟等[14]和段亚佼等[5]报道了恶臭假单胞菌对卡那霉素和诺氟沙星高度敏感。该试验中分离菌株SY4对这两种抗生素的敏感性与之相同。但是杨圆圆等[7]研究的结果显示：恶臭假单胞菌对卡那霉素和诺氟沙星中度敏感，该研究结果与之不同，原因可能是菌株来源，地理环境及用药情况等不同。根据分离菌株SY4对抗生素敏感性的研究结果，高度敏感抗生素中的故米诺环素、庆大霉素等都可作为预防和治疗恶臭假单胞菌的推荐用药。但相关研究表明,随着广谱抗生素的广泛使用，恶臭假单胞菌的耐药性越来越强，使得对恶臭假单胞菌的治疗更加困难[15]。因此，通过益生菌调节鱼类肠道微生物的种群数量可能是预防和治疗该病的策略之一。