顾 雪，余美玲，肖成炜，张苗苗，王才智

卵巢癌是女性生殖器官最常见的三大恶性肿瘤之一，在妇科恶性肿瘤中发病率居第2位，其病死率居首位[1]，其中卵巢浆液性癌占卵巢癌的75%。由于卵巢位置较深，早期病变不易发现，缺乏特异的早期临床表现及诊断方法，约70%的卵巢癌病人在发现时已属晚期，并有广泛的盆腔、腹腔、淋巴结转移或腹水形成[2]。

研究[3]表明，内质网应激(ERS)反应可能与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。而葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是一种内质网分子伴侣，在ERS出现时其表达上调[4]。GRP78的主要功能包括促进新合成蛋白的折叠、聚集，识别内质网中的异常折叠蛋白并诱导其降解，充当内质网应激感受器等。随着对GRP78 细胞内定位认识的不断深入，研究[5-6]发现除内质网外，肿瘤细胞表面也存在 GRP78 的表达。细胞表面 GRP78 被认为是一种受体样多功能蛋白，可以通过与不同的配体结合，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移和耐药性中发挥重要的调节作用[7-8]。目前，细胞表面 GRP78 在调节肿瘤侵袭转移中的作用及可能的分子机制已成为研究的热点。本研究拟通过免疫组织化学法和Western blot检测GRP78在卵巢浆液性癌及卵巢浆液性囊腺瘤的表达情况，探讨GRP78在卵巢癌的发生发展、侵袭转移中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 低转移潜能卵巢癌细胞HO-8910、高转移潜能卵巢癌细胞HO-8910PM购于上海通派生物科技公司。二甲基亚砜从Sigma-Aldrich公司购买。GRP78一抗以及二抗从Cell Signaling公司购买。shRNA-GRP78、pcDNA-GRP78和LipofectamineTM2000均从上海吉玛基因公司购买。

收集2013年12月至2018年12月蚌埠医学院第二附属医院存档的60例卵巢浆液性癌组织及同时期40例卵巢浆液性囊腺瘤组织标本。卵巢癌病人年龄46～72岁；组织学类型均为浆液性腺癌；病理分级低级23例，高级37例；临床分期Ⅰ、Ⅱ期25例，Ⅲ、Ⅳ期35例；术后经病理证实有淋巴转移者13例，无淋巴转移者47例；有盆腔转移者36例，无盆腔转移者24例；盆腔外转移者19例，无盆腔外转移者41例。卵巢囊腺瘤病人年龄20～66岁，均为浆液性囊腺瘤。病例均经手术和病理确诊，术前均未接受放疗、化疗和免疫治疗等相关治疗，有完整临床及病理资料。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学法测定GRP78的表达，样本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，制成5 μm连续切片；然后依次经过脱蜡、脱苯、水化、抗原修复、封闭内源性过氧化物酶后，于室温下静置20 min，随后在4 ℃孵育一抗过夜。然后切片孵育带荧光标记的二抗，室温下孵育20 min，PBS洗片3次，每次5 min，滴加DAB显色溶液染色2 min，并将切片置于显微镜下观察显色结果；终止反应后以苏木素复染1 min，盐酸乙醇分化、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，待中性树胶干后，置于显微镜下观察拍片，并对阳性染色进行观察。对染色的细胞进行如下评分：显色细胞≤10%，为阴性(-)；显色细胞>10%～25%，为阳性(+)；显色细胞>25%～50%，为阳性(2+)；显色的细胞≥50%，为阳性(3+)。按GRP78表达情况进行分层，显色阳性细胞<50%为低表达GRP78组，而显色阳性细胞≥50%为高表达GRP78组，比较2组卵巢浆液性癌病人临床指标之间的关系。

1.2.2 Western blotting法检测蛋白表达 组织蛋白提取操作步骤如下：取-80 ℃保存的卵巢浆液性癌组织和卵巢浆液性囊腺瘤组织标本，在液氮下碾成粉状，冰上裂解30 min，匀质，1 000 r/min离心10 min，收集上清液。细胞蛋白提取操作如下：取生长状态良好的细胞，使用胰酶消化细胞，收集细胞悬液于4 mL的离心管中，2 500 r/min离心10 min，弃上层液体，加细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心收集样品。BCA法检测样品蛋白含量，蛋白定量后与上样缓冲液1∶1混合，100 ℃煮沸5 min，变性的蛋白于-20 ℃保存。每道上样30 μg蛋白，经聚丙稀酰胺凝胶电泳后湿式转膜。PVDF膜放入5%脱脂奶粉中，室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，最后在暗室中显影、定影、洗净、晾干。采用图像分析软件Gene Tools V3.04b分析蛋白条带灰度，以β-actin作为内参对照。

1.2.3 HO-8910、HO-8910PM细胞株转染 转染细胞分为3组：对照组、阴性对照组和shRNA-GRP78或pcDNA-GRP78组。依据试剂盒操作步骤，将细胞接种于6孔板中培养24 h，使用LipofectamineTM2000将shRNA-GRP78、pcDNA-GRP78分别转染至HO-8910细胞、HO-8910PM细胞，再加入无血清培养液培养6 h，吸去上述液体，加入正常培养基进行培养。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭、迁移能力 取对数生长期细胞接种于铺有30 μL Matrigel基质胶的Transwell 板上室。下室为600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。常规培养48 h后，用棉签擦去上层细胞，下层细胞用4%多聚甲醛固定并用结晶紫染色。将固定染色的细胞置于倒置显微镜下观察拍照，任选5个视野进行计数，取平均值。

1.3 统计学方法 采用两独立样本t检验、χ2检验、方差分析和q检验。

2 结果

2.1 GRP78在卵巢浆液性癌和卵巢浆液性囊腺瘤组织中的表达 免疫组织化学结果显示，GRP78蛋白定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒(见图1)，40例卵巢浆液性囊腺瘤组织中GRP78阴性表达30例(75%)，GRP78阳性表达10例(25%)，60例卵巢浆液性癌组织中GRP78阴性表达6例(10%)，阳性表达54例(90%)；卵巢浆液性癌组织中GRP78阳性表达明显高于卵巢浆液性囊腺瘤组织(χ2=44.01，P<0.01)。Western blotting结果显示，GRP78在卵巢浆液性癌组织的蛋白表达明显高于卵巢浆液性囊腺瘤组织(见图2)。

2.2 GRP78的表达与卵巢浆液性癌临床病理指标之间的关系 GRP78的表达量与病人的病理分级相关，GRP78表达量越高，卵巢浆液性癌病人病理分级程度越高，临床病理分期分析结果与病理分级结果一致。且与低表达GRP78的卵巢癌病人相比，高表达GRP78组的病人，糖类抗原125(CA125)指标更高。发生淋巴结转移、盆腔转移、盆腔外转移的比例更高(P<0.01)(见表1)。

2.3 GRP78在HO-8910细胞和HO-8910PM细胞中的表达 结果显示，与HO-8910细胞比较，HO-8910PM细胞中GRP78的表达明显增加(见图3)。Transwell法检测结果表明，与HO-8910细胞比较，HO-8910PM细胞的侵袭、迁移能力明显升高(见图4～5、表2)(P<0.01)。

表1浆液性卵巢癌临床指标与GRP78的表达水平的关系[n；百分率(%)]

项目GRP78表达量<50%(n=28)GRP78表达量≥50%(n=32)χ2P年龄/岁 57.57±11.15 60.16±11.34-0.89∗>0.05肿瘤直径/cm11.00±6.1213.54±5.24-1.10∗>0.05CA125/(U/mL)144.00±121.25647.31±499.98-5.51∗<0.01病理分级 低级 高级20(86.92)8(21.63)3(13.17)29(78.43)24.33<0.01临床病理分期 Ⅰ、Ⅱ期 Ⅲ、Ⅳ期22(88.01)6(17.12)3(12.04)29(82.93)29.42<0.01淋巴结转移 无 有28(60.93)0(0.02)18(39.17)14(100.01)15.98<0.01盆腔转移 无 有22(91.76)6(16.75)2(8.34)30(83.33)32.54<0.01盆腔外转移 无 无25(62.06)3(15.83)16(38.02)16(84.28)10.650.01

*示t值

2.4 改变GRP78的表达水平对卵巢癌细胞侵袭、迁移潜能的影响 在HO-8910细胞中过表达GRP78，细胞的侵袭、迁移能力明显升高(P<0.01)(见图6～8、表3)。而在HO-8910PM细胞中干扰GRP78的表达，细胞的侵袭、迁移能力明显降低(P<0.01)(见图9～11、表4)。

分组 侵袭细胞数 迁移细胞数HO-8910细胞 34.20±8.23 16.60±6.35HO-8910PM细胞 113.00±14.21 69.40±4.16t -10.73 -15.56P <0.01 <0.01

分组 侵袭细胞数 迁移细胞数 对照组 34.20±8.23 16.60±6.35 阴性对照组 34.40±9.56 17.80±5.98 pcDNA-GRP78组 108.60±18.89 64.80±10.35F 53.51 61.86P <0.01 <0.01MS组内 9 200.867 3 778.067

分组 侵袭细胞数 迁移细胞数 对照组 111.40±14.28 69.40±4.16 阴性对照组 106.00±6.33 66.40±8.30 shRNA-GRP78组 39.80±8.44 19.80±5.68F 75.70 98.07P <0.01 <0.01MS组内 7 948.467 3 867.267

3 讨论

正常细胞在缺氧、酸中毒等应激状态下会产生ERS，ERS可导致细胞内GRP78含量增加，使细胞的耐受性增强，保护细胞抵抗有害刺激的损伤，保持内环境稳态[9]。在肿瘤细胞中，ERS成为其主要反应方式，从而导致GRP78持续升高，使肿瘤细胞对缺氧、酸中毒等因素的耐受性增加[10]。GRP78高表达存在于多种肿瘤中，包括泌尿系、消化系、乳腺、脑和呼吸系统肿瘤等[11]。ZHANG等[12]在消化系统肿瘤研究中发现，GRP78的表达升高与胃癌的淋巴结转移呈正相关关系，并导致病人的不良预后。使用RNAi技术定向下调GRP78表达，可明显降低胃癌细胞的淋巴转移能力。同样在头颈部肿瘤研究中，CHIU等[13]以RNAi技术定向基因敲除GRP78在多个头颈部鳞癌培养细胞系中的表达发现，在基因敲除鳞癌细胞系中，反映肿瘤转移能力的局部细胞克隆团块形成能力从53%下降至12%，并且在原位体外肿瘤转移抑制率可达到67%，抑制肝转移率降低约90%。

本研究检测了GRP78在卵巢浆液性癌及卵巢浆液性囊腺瘤标本中的表达，免疫组织化学检测结果显示卵巢浆液性癌组织中GRP78阳性细胞的比例明显高于卵巢浆液性囊腺瘤组织。在本研究中，首次观察到了GRP78表达量高的卵巢浆液性癌病人，肿瘤分级和临床病理分期更高，CA125水平更高、肿瘤体积更大。且GRP78表达量高的病人，发生淋巴结转移、盆腔转移、盆腔外转移所占比例更高。以上结果说明GRP78可能为卵巢癌病人重要的预后因子。

体外研究中，Western blot结果显示，与转移潜能低的HO-8910细胞相比，转移潜能高的HO-8910PM细胞GRP78表达明显升高。在HO-8910细胞中过表达GRP78，细胞发生侵袭、迁移能力增强；相反，在HO-8910PM细胞中沉默GRP78可以降低细胞的侵袭、迁移能力。

本研究仅揭示了GRP78可促进卵巢癌的侵袭、迁移，但GRP78如何促进卵巢癌的转移尚不清楚。有研究报道，GRP78的表达水平与肝癌细胞的恶性程度呈正相关关系，它通过激活FAK及MMP-2促进肝癌的侵袭转移[14-15]。在前列腺癌中，GRP78 与活化的α2巨球蛋白结合，激活 PAK2，导致 LIMK 和 Cofillin磷酸化，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移；在人畸胎瘤和乳腺癌中，GRP78与 Cripto-1直接结合，抑制TGF-β介导的Smad2/3磷酸化，激活MAPK/PI3K信号通路，下调E-cadherin的表达，促进肿瘤细胞增殖、 侵 袭 和 转 移；在 结 肠 癌 中，GRP78与β1- Integrin结合，活化FAK，激活尿激酶型纤溶酶原，促进细胞外基质的降解，调节肿瘤侵袭和转移[16-18]。

总之，该研究揭示了GRP78可以影响卵巢癌细胞的侵袭迁移能力，提示GRP78可能是卵巢癌病人重要的预后因子之一，但还需要体内实验和对病人随访进一步证实。