赵永鑫 ，王晓红，王 英，郭宇航，范学财，王 勇，包名家，张晓丽*

(1．佳木斯大学 附属第一医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154007；2．佳木斯大学 附属第二医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154003；3.佳木斯市疾病预防控制中心，黑龙江 佳木斯 154000)

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)是医院主要的条件致病菌[1]。由于碳青霉烯类药物的广泛应用，近年来，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(Carbapenem ResistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)在世界范围蔓延的报道屡见不鲜[2]。细菌生物膜存在于各种物体表面，几乎所有的细菌都具有形成生物膜的能力。鲍曼不动杆菌在48 h内就能够形成成熟的生物膜，其相关感染最常见的就是医疗设备感染[3]，特别是医院入侵设备，如机械通气、气管插管等。生物膜的形成在一定程度上促进了菌株在医院环境中的定殖、播散、流行。本研究通过MLST及ERIC-PCR分析佳木斯大学附属第一医院CRAB的分子分型及同源性，通过对比分析CRAB与碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(Carbapenem-sensitiveAcinetobacterbaumannii，CSAB)生物膜形成能力，讨论生物膜形成与碳青霉烯类耐药性获得的相关性，为控制其交叉感染和传播提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2013至2014年佳木斯大学附属第一医院临床分离CRAB 35株，剔除重复菌株，采用VITEK II全自动细菌鉴定仪对菌株鉴定并进行体外敏感实验，E-test法测定亚胺培南和美罗培南。筛选菌株于-80 ℃保存备用，根据简单随机抽样原则从CSAB中选取38株作为生物膜形成能力分析的对比菌株。

1.1.2 主要试剂 PCR-MⅨ购自promega corporation USA，结晶紫购自珠海贝索生物有限公司，E-test试纸条购自郑州安图生物股份有限公司，7对管家基因及ERIC引物核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 MLST 煮沸法制备DNA模板。PCR 扩增7个管家基因https：//pubmlst.org/abaumannii/info/primers_Pasteur.shtml，序列见表1。PCR反应条件为 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR产物进行电泳，100 V 50 min，PCR产物送上海生工生物公司测序。序列分析使用Pasteur MLST 将测序后序列输入网站(http：//pubmlst.org/abaumannii/)进行序列查询，最终确定ST型。

表1 管家基因引物序列Table 1 Housekeeping gene primer sequences

1.2.2 ERIC 引物ERIC-2 (AAGTAAGTGACTGG-GGTGAGCG)，PCR反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，40 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min,30个循环；65 ℃ 6 min。

1.2.3 结晶紫染色法生物被膜形成能力定量分析 取单个菌落于4 mL LB肉汤120 r/min 培养18 h；生理盐水配制成0.5麦氏浊度，96孔板加入200 μL肉汤，实验菌液10 μL，4复孔，35 ℃培养24 h；PBS缓冲液冲洗3次；加入1∶10稀释的甲醛200 μL固定15 min；200 μL结晶紫染色15 min；去离子水冲洗，200 μL无水乙醇轻微震荡10 min，570 nm处读取吸光值，重复3次，取均值为该菌株最终D值。生物被膜形成能力定量判读标准[4]：测定阴性对照(LB肉汤)吸光值N，平均N+3S定义为Dc，将待测菌株D值与Dc进行比较：阴性(-)：D≤Dc；弱阳性(1+)：Dc4Dc。

1.2.4 统计分析 采用SPSS2.0统计软件，Kruskal-Wallis秩和检验比较CRAB与CSAB生物被膜形成能力，组间多重比较采用Bonferroni方法进行校正。P<0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 ICU鲍曼不动杆菌检出率

2014至2017年佳木斯大学附属第一医院ICU检出耐鲍曼不动杆菌189株，CRAB的检出率从2014年的92.00%降低至2017年的11.39%(表2)。

表2 2014至2017年ICU患者检出鲍曼不动杆菌及CRAB检出率(%)Table 2 Detection of Acinetobacter baumannii (%)and CRAB (%)in ICU patients in 2014-2017

2.2 药敏实验结果

CRAB除复方新诺明(17.14%)、妥布霉素(2.86%)、左氧氟沙星(36.36%)、头孢哌酮/舒巴坦(91.30%)、替加环素(100%)以外，其余全部耐药，CSAB对14种抗生素的敏感率均大于80.00%，具体见表3。

2.3 耐药基因携带结果

CRAB携带OXA类酶情况，结果如表4所示。部分样本多重PCR电泳结果见图1。

2.4 MLST及ERIC结果

在检测的35株CRAB中，33株ST 2型，是佳木斯大学附属第一医院主要流行克隆型，主要分离于ICU(16/35)和急诊(9/35)，分离样本主要是痰液(80.82%)。ST 671型也被发现，在将测序结果拼接比对时，发现1株新型，将其命名为ST 1199型，见表4。ERIC-PCR 结果显示分为A、B、C、D四型，A型9株，B型24株，C型1株，D型1株。部分电泳图结果见图2。

表3 CRAB与CSAB的药敏分析Table 3 Susceptibility analysis of CRAB and CSAB

图1 blaOXA-23、blaOXA-51和blaOXA-24多重PCR电泳图Fig.1 Electrophoretogram of blaOXA-23，blaOXA-51 and blaOXA-24 by multiple PCR M：1 500 bp Marker；OXA-23(73，142)；OXA-51(22，73，85，86，142)；OXA-24(22)

图2 部分菌株 ERIC-PCR 图谱Fig.2 The partial result of genotyping by using ERIC-PCR method M：Marker(bp)；70：A型；111、114、116、118、122、126、131、132：B型；77：C型；125：D型

表4 碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的分子特征及耐药基因Table 4 Molecular characteristics and drug resistance genes of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

注：ERIC为肠道细菌基因重复序列；MLST为多序列位点分型；“+”为存在耐药基因；“-”为不存在耐药基因

2.5 生物被膜检测结果

对73株临床分离的CRAB与CSAB进行生物膜形成能力的定性分析，检测结果见表5，判定标准如前所述。统计分析结果提示佳木斯大学附属第一医院CRAB组总体上生物膜形成能力较CSAB组下降(0.330±0.258、0.534±0.402，Z=2.843，P=0.004)，提示碳青霉烯类耐药性的获得可导致生物膜形成能力的下降。

表5 CRAB与CSAB生物膜形成能力定性分布Table 5 Qualitative distribution of CRAB and CSAB biofilm formation capacity

2.6 blaOXA基因携带与生物膜形成能力的相关性

根据OXA酶携带情况，分为3组，1组代表blaOXA-23(-)blaOXA-51(+)，2组代表blaOXA-23(+)blaOXA-51(+)，3组代表blaOXA-24(+)，4组为CSAB对照组，其生物膜形成能力见图3，图中的点是各菌株生物膜吸光度的平均值，每组的均值已经列出。统计分析结果显示CRAB生物膜形成能力与3种耐药基因携带情况均无明显相关性(P=0.369)，具体见表6。

表6 blaOXA基因与生物膜形成能力的相关性Table 6 Correlation of blaOXA gene with biofilm formation ability

图3 CRAB与CSAB生物膜形成能力Fig.3 Biofilm formation in the CRAB and CSAB

3 讨 论

鲍曼不动杆菌耐药机制复杂，除了其固有的抗药性外，还可以获得抗药基因，包括产碳青霉烯酶，外膜孔蛋白缺失，青霉素结合位点改变，外排泵的高度表达，生物膜的形成等。碳青霉烯酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素的一类β-内酰胺酶。Ambler分类包括A、B、D类酶。碳青霉烯水解D类β-内酰胺酶(CHDLs)，也称为苯唑西林酶(OXA)，是在鲍曼不动杆菌临床分离株中发现广泛的β-内酰胺酶。已鉴定出6个群，包括OXA-51-like、OXA-23-like、OXA-40/24-like、OXA-58-like、OXA-143-like和OXA-48-like[5]。佳木斯大学附属第一医院发现的D类酶为blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-24，其主要的耐药机制是产blaOXA-23[6]，这一发现与俄罗斯和中东地区的结果相似[7-8]。有报道称blaOXA-23的携带可以增加CRAB在医院暴发的风险因素[9]。

分子流行病学在监测CRAB的流行及暴发感染方面具有重要的作用。鲍曼不动杆菌临床分离株MLST的种群结构由I、II和Ⅲ的三个国际克隆谱系组成，CC1(ST 1、ST 7、ST 8、ST 19和ST 20)，CC2(ST 2、ST 45和ST 47)，CC3(ST 3和ST 14)，大多数暴发菌属于CC1和CC2[10]。ST 2型是世界上鲍曼分布最广的ST型[11]，对于佳木斯大学附属第一医院ST 2型的暴发，与我国安徽地区报道分型一致，意大利也有对于ST 2型院内暴发的报道[12-13]，说明本地区与世界流行克隆具有同源性。有研究发现[14]，ST 2型与OXA类酶(OXA-23或OXA-24)有关，这与本研究结果一致。从2014年起，佳木斯附属第一医院采取合理措施对可能的影响因素进行控制，例如：医院内空气、地面、机器设备进行彻底消毒处理；医务人员严格执行无菌操作规章制度，取得了初步成效。由此可见，造成ST 2型在医院暴发的最可能影响因素为医务人员的消毒意识不足，其次在ICU中多为免疫力低下的患者，增加了感染概率。

细菌生物膜是指细菌在生长过程中黏附于生物或非生物表面，由细菌自身分泌的胞外多糖基质组成的细菌群体，是水平基因转移的极好环境，可导致耐药基因的获得[15]。苛刻条件下，在生物膜群落内会使耐药基因水平转移并选择出形成能力高的菌株。临床分离的鲍曼不动杆菌几乎都有形成生物膜的能力，其检测主要分为定性法和定量法，本研究采用标准微量滴定板法，通过测量结晶紫的吸光度，定量检测生物膜的含量。抗生素耐药与生物膜形成是CRAB在医院流行的主要原因[16]。生物膜使鲍曼不动杆菌适应恶劣的环境，抑制抗生素对细菌的杀灭作用，使CRAB引起的感染在临床中很难治愈。有研究发现[17]，菌毛合成系统、BfmRS双组分调控系统、细菌QS、生物膜相关蛋白(Bap)及外膜蛋白都对鲍曼不动杆菌生物膜的形成有影响。本研究中，CRAB生物膜形成力相对弱于CSAB组，与Babapour等[18]的报道一致，且与blaOXA携带情况无明显相关性。由于佳木斯大学附属第一医院CRAB菌株较少，且主要克隆流行ST 2型，所以无法全面分析各ST分型在生物膜形成能力上的区别。另外，生物膜作为重要的毒力因素，没有对鲍曼不动杆菌的致病力和毒力进行分析，需要进一步研究。

总之，这是佳木斯大学附属第一医院首次对于CRAB流行病学情况进行分析与研究，生物膜的形成与院感密切相关。针对医院ST 2型CRAB的暴发，应该在合理应用治疗药物同时，加强严格消毒的意识，特别是在进行侵入性操作时，应切断交叉感染途径，降低院内感染暴发的风险。