都田赵,王雪莲

(中国医科大学 病原生物学教研室,辽宁 沈阳 110122)

宫颈癌是严重威胁妇女健康的主要疾病之一。我国是宫颈癌的高发区，每年新发病例及死亡病例占世界病例总数的四分之一以上[1]。近年宫颈癌发病呈现年轻化的趋势[2-3]，年轻宫颈癌患者(≤35岁)在全部宫颈癌病例中所占比例由原来的3.42%升至近年的24.91%[2]。已有证据表明宫颈癌的发生、发展和转归受DNA甲基化、微小核糖核酸表达异常[4-6]等分子遗传学机制调控。环状RNA(circular RNA，circRNA)通过多种机制调控基因的表达，进而在包括恶性肿瘤在内的疾病发生发展中发挥重要作用[7-8]。前期研究中，我们发现circRALB在宫颈癌组织中高表达。通过检索circBase数据库可知，circRALB是来源于2号染色体RALB基因编码区的环状RNA。目前对于circRALB的研究尚未见报道，其发挥的生物学功能也不明确。本研究探讨circRALB对宫颈癌细胞株Hela细胞生物学行为的影响，明确circRALB在宫颈癌发生发展中的作用，进而为宫颈癌的靶向性治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 宫颈癌细胞株Hela细胞源自中国医科大学病原微生物学教研室，jetPRIME转染试剂购自达科为生物技术公司，TRIzol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒、定量PCR试剂购自Promega公司，Annexin V-FITC/PI Kit凋亡检测试剂购自四正柏生物公司，circRALB干扰序列(si_RALB：ACAAGCUCUUCAGUGGGUCAU)、无关序列(si_nc：GCACG/ideoxyu/CCGUAUACGUA-AAGCUU)、荧光无关序列(si_nc_FAM：GCACG/ideoxyu/CCGUAUACGUAAAGCUU-FAM)、RALB上游引物(AGCCCTGACGCTTCAGTTC)、RALB下游引物(AGCGGTGTCCAGAATATCTATCT)、内参18S上游引物(GAAACGGCTACCACATCC)、18S下游引物(ACCAGACTTGCCCTCCA)均由生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要仪器设备 高温灭菌CO2培养箱(Thermo-371，美国赛默飞)；超净工作台(DL-CJ-2N，北京哈东联)；冷冻离心机(Allergra X-15R，美国贝克曼)；倒置显微镜(CKX31，日本奥林巴斯)；倒置荧光相差显微镜(Leica DMi8，德国莱卡)；荧光定量PCR仪(LightCycler®480，瑞士罗氏)；流式细胞仪(AccuriC6，美国BD 生物科学)；光吸收酶标仪(TECAN Sunrise，瑞士帝肯)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hela细胞采用含10%胎牛血清的1640培养基培养(内含青霉素100 u/mL，链霉素0.01 mg/mL)。培养箱条件为温度37 ℃，CO2浓度5%。待细胞状态良好时进行实验。

1.2.2 细胞转染 细胞接种于12孔板，接种量为每孔1×105个。待细胞生长至60%融合度时进行转染。将干扰序列(si_nc_FAM/si_nc/si_RALB)分别加入含有100 μL jetPRIME Buffer的离心管中，干扰序列转染量为每孔板50 nmol/L。随后向离心管中加入3 μL jetPRIME reagent，斡旋10 s。常温孵育15 min后，将其逐滴加入到含5%血清的Hela细胞中。

1.2.3 计算转染效率 使用倒置荧光显微镜，分别在明场下和荧光场下观察同一视野转染si_nc_FAM的Hela细胞，转染效率=荧光场发荧光细胞数/明场总细胞数。观察3个视野，计算均值。

1.2.4 荧光定量 PCR检测circRALB表达 TRIzol法提取总RNA，验证浓度及纯度后，逆转录为cDNA。逆转录PCR条件为退火25 ℃，5 min；延伸42 ℃，60 min；70 ℃，15 min；4 ℃保存。用circRALB的特异引物及SYBR Green I 荧光染料进行定量PCR检测，所用内参为18S。荧光定量PCR 反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，共45个循环。相对定量结果采用2-ΔΔCt法。2-ΔΔCt=2-(ΔCt si_RALB-ΔCt si_nc)，ΔCt si_RALB=si_RALB组Ct值的均值-对应内参18S的Ct值的均值，ΔCt si_nc=正常组织si_nc组Ct值的均值-对应内参18S的Ct值的均值，并将si_nc组的相对表达量定为1。

1.2.5 细胞计数 转染24 h后，用细胞计数板计数，显微镜下计数左上、左下、右上、右下4个中方格中细胞数，取均值计算细胞浓度。

1.2.6 MTS法检测细胞增殖活性 瞬时转染后，将5×103个细胞接种于96孔培养板中，设3个复孔；每孔加完全培养基(1640+10%胎牛血清)100 μL；37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，每孔加入MTS试剂20 μL，培养箱孵育。在490 nm波长下，用酶标仪检测培养细胞的光密度(OD)。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 转染48 h后，收集 2×105个细胞，每 100 μL细胞悬液加入 5 μL AnnexinV-FITC试剂混匀，避光孵育5 min。再加入5 μL PI试剂。随后加入400 μL PBS。在1 h内进行检测，观察细胞凋亡情况。

1.2.8 细胞划痕实验检测细胞的迁移功能 转染后24 h，收集细胞，接种细胞至6孔板中,细胞浓度为5×105个/孔。次日用200 μL枪头在6孔板底部划直线，PBS洗涤后加入无血清培养基常规培养。在0、24 h时间点拍照，比较细胞的迁移功能。

1.2.9 Transwell小室检测细胞的侵袭功能 向Transwell小室中加入100 μL无血清1640培养基细胞悬液，细胞数为1×105个。底部小室加入含 10% 胎牛血清的 1640 培养液，常规培养24 h。用4%多聚甲醛1 mL室温固定30 min，结晶紫染色20 min。擦去小室底部内表面的细胞，正置于载玻片上，在100倍光镜下随机取3个视野，计数穿膜的细胞数。

2 结果与分析

2.1 干扰序列在Hela细胞中的转染效率

为评价circRALB的干扰序列转入到Hela细胞中的效率，转染带有荧光标记FAM的无关序列到Hela中(图1)。12 h后，用荧光显微镜观察同一视野下的明场和荧光场细胞，计算转染效率。结果显示，转染效率为(89.67±3.1)%。

图1 荧光显微镜观察无关序列的转染效率Fig.1 The transfection efficiency of extraneous sequences under one fieldA：明场；B：荧光场A：Bright field；B：Fluorescence field

2.2 si_RALB显著抑制Hela细胞中circRALB的表达

转染si_RALB后24 h，检测样本中circRALB的表达情况见图2。si_RALB转染组的circRALB表达量为si_nc组的(47.3±1.5)%，且结果有显著的统计学差异(t=7.813，P<0.05)。

图2 si_RALB干扰circRALB的表达情况Fig.2 si_RALB interferes the expression of circRALB*P<0.05，表示统计学差异，下图同

2.3 si_RALB对Hela细胞增殖的影响

转染后计数细胞，实验组细胞数(9.5±1.13)×104显著少于对照组(14.17±0.68)×104，差异有统计学意义(t=3.542，P<0.05，n=3)。MTS法检测si_RALB对Hela细胞增殖的影响。在第4小时，si_RALB组细胞的OD490值(1.132±0.031)与si_nc组(1.442±0.031)相比显著降低，差异有统计学意义(t=8.195，P<0.05，n=3)，表明si_RALB对Hela细胞的增殖能力有显著影响(图3)。

图3 si_RALB对Hela细胞增殖影响的结果Fig.3 Effects of si_RALB on Hela proliferationA：转染24 h后，细胞计数结果；B：转染24 h后，MTS检测结果A：the cell count after transfection 24 hours；B：the MTS test result after transfection 24 hours

2.4 si_RALB对Hela细胞的凋亡的影响

流式细胞术双染法检测各组细胞的凋亡情况，结果显示si_RALB组细胞凋亡率(9.17±1.17)%，si_nc组细胞凋亡率(7.2±0.32)%，control组细胞凋亡率(5.63±0.31)%，si_RALB组细胞凋亡率大于si_nc组细胞凋亡率，但无显著统计学差异(t=1.386，P>0.05，n=3)，表明si_RALB对Hela细胞的凋亡无显著影响(图4)。

图4 转染后48 h三组细胞的凋亡示意图Fig.4 Apoptosis of three groups after transfection 48 hoursA：空白对照组；B：si_nc转染组；C：si_RALB转染组；D：凋亡细胞统计图A：control group；B：si_nc transfection group；C：si_RALB transfection group；D：Statistical histogram of apoptotic cells

2.5 si_RALB对Hela细胞的迁移能力的影响

转染24 h后进行划痕实验，通过观察划痕愈合能力检测各组细胞的迁移能力。通过观察0 h和24 h的划痕结果发现，si_RALB转染组与si_nc组相比，划痕间距缩小不明显(图5)。结果表明转染si_RALB后，Hela细胞的迁移能力下降。

图5 0 h和24 h三组细胞的划痕间距示意图Fig.5 The display of scratch test results of three groups at 0 h and 24 h

2.6 si_RALB对Hela细胞侵袭能力的影响

Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力，方差分析进行组间比较。si_RALB转染组Hela细胞穿膜数为(21.33±2.19)个，显著低于si_nc组(45.33±1.76)个和control组(52±1.53)个(F=76.35，P<0.05，n=3)。实验结果表明si_RALB能显著降低Hela细胞的侵袭能力(图6)。

图6 si_RALB对Hela细胞侵袭能力的影响Fig.6 Influence of si_RALB on the invasiveness of Hela cellsA：三组细胞的穿膜情况镜下示意图；B：三组细胞的穿模数统计图A：The invasion of three groups under the Microscope；B：Statistical histogram of invasion results

3 讨 论

持续性高危型人乳头瘤病毒感染与宫颈癌的发生密切相关。人乳头瘤病毒预防疫苗的成功研发对宫颈癌的预防做出了重大贡献，但肿瘤治疗仍要面对肿瘤细胞异质性和机体复杂免疫微环境等新的挑战[9-10]。在一些发展中国家，通过疫苗接种预防宫颈癌在短期内仍然难以实现。因此，寻找新的宫颈癌分子生物标志物及治疗靶点仍是一个热点问题。

Salzman等[11]提出circRNA广泛存在于包括人类在内的真核细胞中，随后，Jeck等[12]在人类的成纤维细胞中检测出高达25 000多种circRNA。随着研究的进一步深入，人们开始意识到circRNA在人体普遍存在[13]，circRNA可以与微小RNA(microRNA，miRNA)结合，遵循互补碱基配对的原则，通过竞争性地与miRNA反应元件(MREs)结合，发挥miRNA海绵作用，功能性释放mRNA，逆转miRNA下游基因的抑制作用，从而增加了目标基因的表达[14-15]。因此，circRNA可能在人类疾病谱中有重要作用。研究 circRNA及其作用机制，对寻找疾病诊断的治疗靶点和进行疾病相关治疗均有重要意义。

我们前期用circRNA微阵列芯片分析检测了宫颈癌组织的circRNA表达谱，发现circRALB在宫颈癌组织中高表达，于是采用瞬时转染其干扰序列的方法，来研究circRALB在Hela细胞中的生物学功能。瞬时转染方法简单、快捷，避免复杂表达载体的构建和可能形成的干扰，有效抑制特定circRNA的表达。本研究的瞬时转染效率为(89.67±3.1)%，保证了干扰序列进入细胞后的干扰效率。

细胞的增殖和凋亡异常在恶性肿瘤的发生发展中占有重要地位。我们发现，下调circRALB的表达对Hela细胞的增殖有明显影响，提示circRALB可能会与肿瘤形成过程中瘤体大小有关。si_RALB转染后，细胞凋亡情况变化并不显著。可能导致此结果的原因有以下几方面。首先，虽瞬时转染效率在转染后12 h高达(89.67±3.1)%，但凋亡检测时间为转染后48 h，且si_RALB对circRALB的干扰效率为53%，可能是其不足以产生凋亡的变化的原因；其次，si_RALB的干扰作用是基于与circRALB的碱基互补配对机制来产生，其有效性可能是有限的；第三，circRALB可能在促进细胞的凋亡方面不起作用。

转移和侵袭是宫颈癌的恶性生物学行为。通过转染si_RALB后，Hela细胞的迁移和侵袭能力显著降低，这一发现可能揭示宫颈癌患者病情晚期出现局部浸润和转移的重要机制。宫颈癌治愈困难，侵袭生长和远处转移是不可缺少的原因，由于si_RALB能抑制宫颈癌细胞系Hela细胞的转移和侵袭，因此，利用反义寡核苷酸技术抑制或降低circRALB的表达水平[16]，对于今后宫颈癌的靶向性治疗具有启发作用。因此，circRALB在宫颈癌肿瘤组织中的差异性表达使其可能成为肿瘤诊断的标志物，甚至是潜在的药物治疗靶点，这为未来宫颈癌circRNA的研究提供方向与参考。