刘江宁 王楚鑫 张宏根 缪一栩 高海林 许作鹏 刘巧泉 汤述翥

水稻黑条矮缩病抗性QTL定位

刘江宁1,2,**王楚鑫1,2,**张宏根1,2,*缪一栩1,2高海林1,2许作鹏1,2刘巧泉1,2汤述翥1,2

1江苏省作物遗传生理重点实验室/ 植物功能基因组学教育部重点实验室/ 江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室/ 扬州大学农学院, 江苏扬州 225009;2江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心/ 扬州大学, 江苏扬州 225009

发掘水稻黑条矮缩病的抗性基因有助于抗病品种的选育, 减少黑条矮缩病对水稻生产的危害。本研究构建了包含222个家系的L5494/IR36重组自交系群体。对该群体进行黑条矮缩病的田间诱发鉴定, 抗性亲本IR36发病率为28.70%, 感病亲本L5494发病率为84.26%, 群体发病率范围为11.21%~89.81%。利用134对分子标记构建覆盖12条染色体的遗传连锁图谱, 总遗传距离为1475.97 cM, 平均标记间距为11.1 cM。利用QTL IciMapping 4.0对抗黑条矮缩病QTL进行分析, 共检测到4个QTL, 其中第1、第2、第9染色体上QTL的表型贡献率分别为12.64%、16.00%和8.43%, 抗病等位基因来自抗病亲本IR36; 第6染色体上QTL的表型贡献率为10.82%, 抗病等位基因来自感病亲本L5494。在此基础上, 利用93-11为供体、日本晴为背景的近等基因系材料, 在定位区间内检测到来自93-11的抗性QTL。本研究结果为水稻黑条矮缩病抗性基因定位及分子标记辅助选择育种提供借鉴。

水稻黑条矮缩病; 重组自交系; QTL定位

水稻黑条矮缩病(rice black-streaked dwarf virus disease, RBSDV)是一种病毒性病害, 主要是由灰飞虱通过持久性不经卵的方式进行传播[1-2]。黑条矮缩病病毒属植物呼肠弧病毒组病毒, 由10条命名为S1~S10的双链RNA组成[3-5]。水稻黑条矮缩病毒侵染植株后, 会使病株矮缩, 叶色浓绿僵硬, 叶背、叶鞘和茎秆有早期蜡白色、后期为黑褐色的短条纹不规则突起, 重病株不抽穗, 被称为水稻中的“癌症”。20世纪60年代, 该病害在我国华东地区大规模流行,随后20年中, 其发病规模大大下降, 但在90年代又在江浙等地回升流行, 致使多地区作物产量受到影响[6-8]。2006年后, 水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、山东等地大发生, 造成大面积减产[9], 2013年后, 该病害在江苏已得到控制, 但在河南沿黄部分稻区严重发生[10]。目前, 防治水稻黑条矮缩病的手段主要是使用农药杀灭传毒媒介体灰飞虱。但是由于灰飞虱的数量大、具有迁徙性及耐药性高等因素, 防治效果不佳[11]。因此选育和推广抗病品种是最为经济有效的途径。

黑条矮缩病属于流行性病害, 其发病规律以及发病地点较难掌控, 田间鉴定缺乏稳定性, 人工接种病毒需投入大量的人工, 对大群体诱发存在较大困难。同时, 不同品种带有不同的水稻黑条矮缩病抗病基因, 即使是同一品种在不同研究中也会出现抗感性状不一致现象, 这又给黑条矮缩病抗病基因研究以及抗病品种选育带来一定难度[12]。目前, 对黑条矮缩病抗病基因研究以及抗病育种的报道较少, 不同研究者普遍认为水稻黑条矮缩病抗性是由微效多基因控制, 不同品种带有不同的抗性基因, 抗黑条矮缩病水稻品种的选育需聚合多个抗性基因[13-14]。现已在除水稻第8和第12染色体外其他染色体上共定位到30多个黑条矮缩病抗性QTL[11,15-21],但只有第6染色体上的被精细定位[16]。因此, 有必要加强黑条矮缩病抗性QTL的发掘与定位。

本研究利用一套L5494/IR36重组自交系(recombinant inbred lines, RIL)群体进行黑条矮缩病抗性QTL的定位。根据定位结果, 利用日本晴背景近等基因系对第1染色体上黑条矮缩病抗性QTL进行验证, 将为水稻黑条矮缩病抗性基因的定位及抗病品种的分子标记辅助选育提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2010—2015年, 构建了一套L5494/IR36重组自交系群体, 共获得222个家系, 其中IR36为半矮秆籼稻抗性亲本, L5494为高秆粳稻品系, 对黑条矮缩病表现高感[19]。至2016年夏季, 该群体已自交至F10代。

为充分挖掘籼粳之间有利等位基因, 构建了一套以籼稻亲本93-11为供体, 粳稻亲本日本晴为受体的染色体片段代换系群体, 并通过重测序技术明确了各系背景中的导入片段[22-23]。2017—2018年, 选择携带第1染色体黑条矮缩病抗性QTL导入片段的代换系(编号N9)、日本晴及93-11进行抗性鉴定, 根据抗性鉴定结果来分析93-11中是否存在抗性位点。

1.2 试验方法

1.2.1 黑条矮缩病诱发 已有研究表明, 水稻在秧苗期(二至八叶期)对黑条矮缩病较为敏感[24]。由于近年来黑条矮缩病在江苏发生很轻, 无法对该病进行田间自然诱发鉴定。而河南开封仍为黑条矮缩病重病区, 是该病抗性鉴定的理想地点。因此, 2016年将RIL群体播种于开封, 在秧田期进行水稻黑条矮缩病的田间自然诱发。灰飞虱主要以小麦为寄主越冬, 将鉴定材料播种于麦田附近, 不施用农药, 每天人工将麦田里的灰飞虱驱赶至水稻秧田中, 以增加秧田虫口密度, 保证鉴定材料充分感病。5月12日播种, 6月15日后, 将水稻秧苗移栽至扬州大学试验基地, 采取单苗栽插, 株行距13.3 cm × 25.0 cm, 每个家系54穴, 2次重复。2017—2018年, 将N9、日本晴及93-11以上述同样的方式进行黑条矮缩病诱发, 3次重复, 采取单苗栽插移栽, 株行距不变, 每个重复100穴, 常规水肥管理。

1.2.2 发病率统计 根据表型鉴定, 家系内植株明显矮缩、叶色浓绿僵硬, 判定为病株。水稻分蘖初期对各家系进行第1次黑条矮缩病病株鉴定。由于此时部分感病植株还未发病或病程较轻、表型不太明显, 因此仅用塑料标签对发病症状明显的植株进行标注, 以防稻苗烂死不留痕迹, 影响最终数据的统计。水稻分蘖盛期进行第2次鉴定, 并统计各个株系的发病率, 以各重复发病率的平均值作为表型统计。

1.2.3 DNA的提取及分子标记检测 分别取每个系3张来自于不同单株的叶片混剪, 采用CTAB法[25]提取基因组DNA。PCR体系为模板DNA 2.0 μL, 0.3 μmol L–1的引物2.0 μL, 2×EsMaster Mix (2×EsMaster Mix为含dNTP、Mg2+、buffer、酶的混合液) 8.0 μL, 加ddH2O补足至20.0 μL。PCR扩增程序为95℃预变性5 min, 94℃变性40 s, 53~58℃退火40 s, 72℃延伸30~50 s, 30个循环, 最后72℃保温10 min, 扩增产物经3%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 数据分析及QTL定位 使用Microsoft Excel软件统计群体基因型及发病率, 运用QTL IciMapping 4.0软件[26]进行遗传图谱的构建以及采用复合区间作图法(composite interva1 mapping, CIM)定位QTL, 参照McCouch等[27]方式命名QTL。

2 结果与分析

2.1 群体发病率的鉴定

2016年, IR36自然发病率为28.70%, 较抗RBSDV (图1-A)。L5494的发病率为84.26%, 高感RBSDV (图1-B)。RIL群体各家系发病率范围在11.21%~89.81%之间, 黑条矮缩病诱发充分(图1-C), 各个家系表型的分布图呈现数量性状的特点(图2), 说明该群体对黑条矮缩病的抗性由数量性状位点控制。

图1 IR36、L5494与群体中小区发病情况

A: 亲本IR36; B: 亲本L5494; C: 群体中重病小区。

A: parent IR36; B: parent L5494; C: a susceptible line from RIL population.

图2 重组自交系群体发病率次数分布图

2.2 遗传连锁图谱构建

本课题组之前的研究中, 共筛选出136对在IR36与L5494间具有多态的分子标记[19]。本研究利用其中134对标记对RIL群体中222个家系检测表明, 位于第3染色体10.78~25.11 Mb区段内的标记偏分离, 大多数家系(>95%)检测的基因型与IR36一致, 除此之外, 其他标记均正常分离。根据检测结果构建了包含第3染色体的分子标记遗传图谱, 134对分子标记均匀分布于12条染色体上, 覆盖的遗传距离为1475.97 cM, 标记间平均距离为11.1 cM, 该连锁图谱符合QTL定位的要求(图3)。

2.3 黑条矮缩病抗性QTL的定位

利用构建好的遗传图谱结合各个家系平均发病率表型值, 使用QTL IciMapping 4.0软件进行RBSDV抗性位点定位, 设LOD值为2.5。共检测到4个抗性QTL, 分别位于第1、第2、第6、第9染色体, LOD值分别为4.44、6.89、5.45和3.94, 表型贡献率为12.64%、16.00%、10.82%和8.43%。其中第6染色体上检测到的QTL抗病等位基因来自感病亲本L5494, 第1、第2、第9染色体上检测到的QTL抗病等位基因来自抗病亲本IR36。QTL分布情况以及相关数据如图4和表1所示。

图4 水稻黑条矮缩病抗性QTL在染色体上的位置

表1 L5494/ IR36重组自交系抗病QTL定位结果

2013–2015年QTL数据来源于本课题组前期的研究[19]。

The information of QTL for RBSDV resistance in 2013–2015 was from our former study[19]. PVE: phenotypic variation explained by each QTL.

2.4 抗性位点qRBSDV-1的检验

结合本课题组已有的研究结果,与在2013—2016年间多次被重复检测到,在2015—2016年也能被重复检测到(表1)[19]。其中,已被精细定位[16],在不同研究中也均被定位到[15,21], 而仅在本研究中被定位到。

本课题组发现籼稻品种93-11对黑条矮缩病抗性显著强于粳稻品种日本晴, 同时已构建成一套以93-11为供体、日本晴为背景的染色体片段代换系群体。考虑到本研究中抗病等位基因来源于籼稻抗病品种IR36, 93-11第1染色体相应片段是否也携带与黑条矮缩病抗性有关的QTL？根据93-11为供体、日本晴为背景的染色体片段代换系重测序结果, 发现代换系N9 (图5)除在所在染色体区段具有93-11导入片段外, 背景已基本回复到日本晴。利用两侧标记AP-39.6及RM104对N9、日本晴及93-11进行检测, 结果N9在这两标记处均为93-11带型, 说明N9在目标区段内带有93-11导入片段。

水稻黑条矮缩病鉴定结果显示, 2017年日本晴平均发病率为31.19%, 93-11平均发病率为15.62%, N9平均发病率为26.38%, N9发病率较日本晴显著下降(=0.0474<0.05); 2018年, 日本晴平均发病率为10.33%, 93-11平均发病率为2.00%, N9平均发病率为2.01%, N9发病率仍较日本晴显著降低(=0.0228<0.05)(表2和图6)。上述鉴定结果表明N9在第1染色体导入片段上存在一个来源于93-11黑条矮缩病抗性QTL, 其与可能为同一个抗性位点。

图5 代换系N9的重测序图谱

蓝线、红线分别表示对应SNP位点为日本晴与93-11基因型, 红框表示93-11导入片段。

Each blue line and red line represent single nucleotide polymorphisms of ‘Nipponbare’ and ‘93-11’, respectively. The red box in Chr.1 indicates a substituted fragment derived from 93-11.

表2 日本晴与9311及N9发病情况

*: 0.01<<0.05;**:0.01.

图6 2017年日本晴及N9田间发病情况

A: 日本晴; B: N9。A: Nipponbare; B: N9.

3 讨论

发掘抗性基因和培育抗性品种是解决黑条矮缩病危害的根本策略。目前, 黑条矮缩病研究的难点之一在于该病的诱发与鉴定。该病的诱发可以采用在病区田间自然诱发和人工室内接种的方法。由于人工室内接种费时、工作量大、需要各种设施条件[28],因此, 对于大量种质资源或分离群体的抗性鉴定一般采取田间自然鉴定的方法。周彤等[24]研究表明水稻黑条矮缩病主要在秧苗期诱发, 二叶龄时最易感病, 十叶龄之后几乎不感病。因此, 本研究采取田间自然鉴定的方法, 直接将群体播种于黑条矮缩病重病区河南开封, 在秧田期自然诱发感病。为充分感病, 秧田选择靠近麦田的田块, 并在水稻幼苗期将灰飞虱从麦田驱赶至水稻秧田, 以增加虫口密度。从2016年发病率鉴定结果来看, 整个RIL群体发病很充分, 表明秧田期在病区田间自然诱发黑条矮缩病是可行的。已有的研究表明, 在水稻分蘖盛期, 黑条矮缩病发病表型最明显, 鉴定结果最可信[14,29]。但一些黑条矮缩病重病株会在移栽后很快枯死, 由于病株矮小、田间灌水较深, 在分蘖盛期调查发病率前已腐烂, 会造成调查数据偏差。因此, 本研究对试验材料进行两次鉴定, 第1次在分蘖初期用塑料标签对有明显表型的病株进行标记, 在水稻分蘖盛期第2次鉴定时再统计群体的发病情况, 这使得表型鉴定更为准确, 有助于增强研究结果的可靠性。

2013—2015年间, 本课题组利用L5494/IR36重组自交系群体共定位了12个黑条矮缩病抗性QTL, 分别位于第1、第6、第8、第9染色体, 其中第6、第9染色体上的抗性QTL在多年内均被检测到, 第1、第8染色体上的抗性QTL在群体充分发病的情况下被检测到[19]。本研究利用该套重组自交系群体共检测到4个QTL, 分别位于第1、第2、第6、第9染色体, 其中第1、第6、第9染色体上的抗性QTL与之前研究中定位结果一致, 说明这3个是稳定表达的抗性QTL。潘存红等[15]、Li等[16]利用珍汕97B/明恢63的重组自交系群体共检测到6个黑条矮缩病抗性QTL, 分别位于第6、第7、第9、第11染色体上, 进一步通过构建以明恢63为供体亲本, 感病亲本淮稻5号为轮回亲本的近等基因系, 验证了第6染色体上的抗病QTL, 将基因定位于627.6 kb的物理区间内。本研究中定位到第6染色体上的抗性QTL位置与Li等[16]定位区段重叠, 可能是相同的抗性基因, 不同的是本研究中抗性基因来源是高感亲本L5494, 这说明感病亲本中也存在着抗性基因, 仅利用该基因不足以克服黑条矮缩病对水稻生产的危害。本研究中定位到第9染色体抗性QTL在多个不同研究中均被定位到, 定位区段较为一致, Sun等[17]通过构建苏御糯背景近等系验证了该抗性QTL, 说明该抗性QTL可能广泛存在于抗性种质资源中, 可以应用于抗黑条矮缩病水稻育种。本研究中在第2染色体上定位到的抗性QTL尚未见报道, 但Wang等[30]在第2染色体上相同区段内定位到一处抗灰飞虱QTL, 因此本研究在第2染色体定位的抗性QTL可能为抗灰飞虱位点。此外, 王宝祥等[11]用Koshihikari/桂朝2号RIL群体及Zhou等[18]利用淮稻5号/Tetep的F2:3家系均在第3染色体上定位到了1个抗病QTL, 并且位置相近, 说明第3染色体上极可能存在1个抗性基因, 但在本研究中, 由于第3染色体标记偏分离, 绝大多数家系均表现为IR36的基因型, 因而未能够定位到相关抗病QTL。

本研究定位的抗性QTL在2015— 2016年群体较高发病率情况下能够被重复检测到, 抗性等位基因来源于籼型亲本IR36。王宝祥等[31]研究发现大部分籼稻品种对黑条矮缩病的抗性要优于粳稻品种。本课题组发现籼稻品种93-11对黑条矮缩病也具有较好抗性, 为验证93-11第1染色体相应片段是否也携带与黑条矮缩病抗性有关的QTL, 2017—2018年对93-11为供体、日本晴为背景的近等基因系N9鉴定证实, 93-11第1染色体所在区段的确也存在与黑条矮缩病抗性相关的QTL,推测其可能就是。当然,是否普遍存在于其他籼稻中仍需进一步验证。相关结果将为水稻黑条矮缩病的研究提供借鉴。

4 结论

利用L5494/ IR36的重组自交系群体, 共检测到4个水稻黑条矮缩病抗性QTL, 分别位于第1、第2、第6、第9染色体, 表型贡献率分别为12.64%、16.00%、10.82%和8.43%, 利用近等基因系确定第1染色体上标记AP-39.6与RM104间存在一个抗病位点。这些黑条矮缩病抗性QTL的定位与验证为基因的精细定位、克隆和分子辅助育种奠定基础。

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Mapping of QTLs for resistance to rice black-streaked dwarf disease

LIU Jiang-Ning1,2,**, WANG Chu-Xin1,2,**, ZHANG Hong-GEN1,2,*, MIAO Yi-Xu1,2, GAO Hai-Lin1,2, XU Zuo-Peng1,2, LIU Qiao-Quan1,2, and TANG Shu-Zhu1,2

1Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education / Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Agricultural College of Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;2Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Rice black-streaked dwarf virus disease (RBSDV) may cause great loss of rice production, and breeding resistant varieties is an effective method to control RBSDV. To develop resistant varieties, it is important to screen germplasm that shows RBSDV resistance and to identify the genes/quantitative trait loci (QTLs) contained. In the present study, a set of 222 recombinant inbred lines (RILs) derived from the cross between L5494 (a susceptiblevariety) and IR36 (a resistantvariety) were constructed for RBSDV-resistant QTL mapping. With natural infection test, the RBSDV incidences of L5494 and IR36 were 84.26% and 28.70%, respectively, and the disease incidence of RILs was ranged from 11.21% to 89.81%. Using 134 polymorphic molecular markers, a linkage genetic map was constructed. The map covered a total length of 1475.97 cM with an average interval of 11. 1 cM between adjacent markers. Four RBSDV-resistant QTLs were discovered using QTL IciMapping 4.0 Software, of which,,, andwere from the resistant parent IR36, andfrom the susceptible parent L5494. QTLs,,,andwere located on chromosomes 1, 2, 6, and 9, respectively, which explained 12.64%, 16.00%, 10.82%, and 8.43% of the phenotypic variations. Moreover, a RBSDV-resistant QTL from 93-11 (spp.) at thelocus was confirmed by a near isogenic line that harborsderived from 93-11 with the Nipponbare (spp.) genetic background. Our findings will be benefit for the marker assisted breeding of RBSDV-resistant varieties.

rice black-streaked dwarf viral disease; recombinant inbred line; QTL mapping

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08001002-003), 国家自然科学基金项目(31771743)和江苏高校优势学科建设工程项目资助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08001002-003), the National Natural Science Foundation of China (31771743), and the Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

张宏根, E-mail: zhg@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87972148

**同等贡献(Contributed equally to this work)

2019-01-11;

2019-06-12;

2019-07-09.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20190705.1335.010.html

10.3724/SP.J.1006.2019.92003