游 刚，牛改改*，董庆亮，张自然，郭德军

（广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用高校重点实验室，北部湾大学食品工程学院，广西 钦州 535000）

方格星虫（Sipunculus nudus）又称光裸星虫、沙虫，其在广西北部湾海域的资源较为丰富[1-2]。近年来，关于方格星虫的深加工研究已有相关报道，例如，采用酶解法提取方格星虫生物活性成分或制备酶解肽[3-7]。然而，在加工过程中由于酶水解作用、脂质氧化、蛋白质氧化分解等影响了产品的整体风味和滋味，例如酶解加重了苦味，从而影响其在食品中的应用。Maillard反应可改善酶解物的感官特性和挥发性风味[8-10]，且不同糖影响Maillard反应产物的挥发性风味成分[11-12]。因此，阐明不同糖对Maillard反应产物挥发性风味成分的影响有利于选择较好的糖基供体。气相色谱-质谱联用技术可以定性定量分析挥发性化合物成分变化，但是该技术通常用于分离鉴定单个组分挥发性化合物[13]；然而，可感知的风味或气味通常是由不同挥发性成分混合形成的特征风味，这在一定程度上影响了单个组分具有的风味特征[14]；例如，Aprea等[13]研究发现苹果的感官香味是由不同风味特征的挥发性风味化合物之间相互作用形成的混合气味，尽管醛类、醇类、酮类等化合物独立存在时具有特有的风味，但当不同挥发性化合物混合时能够形成复合特征气味。因此，分离鉴定单一挥发性风味组分来评价其对感官风味品质的贡献具有一定的局限性[13]，而应分析不同挥发性成分形成的混合气味与感官特性之间的相关性。多重变量分析（主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析和偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析）适用于探索不同Maillard反应产物与主要风味成分的相关性、样品之间的聚类性和主要挥发性风味成分与感官特性之间的相关性[15-16]。在前期研究4 种糖（葡萄糖、麦芽糖、木糖和阿拉伯胶）与方格星虫酶解物（Sipunculus nudus enzymatic hydrolysates，SEH）在一定条件下发生Maillard反应特性变化（褐变度、pH值、色差、总/游离氨基酸、荧光强度）的基础上[17]，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用进一步分析SEH与4 种糖的Maillard反应产物挥发性风味成分变化，通过定量描述法分析4 种糖对Maillard反应产物感官特性变化，运用PCA、聚类分析和PLSR分析找出不同Maillard反应产物的主要风味贡献成分并分析其与感官特性的相关性，旨在为改善酶解物的风味和品质、开发新型方格星虫调味提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜方格星虫（体长（10±2）cm，体宽（1±0.5）cm，体质量（9±2）g） 广西钦州东风市场；碱性蛋白酶、风味蛋白酶 索莱宝生化试剂有限公司；1-辛烯-3-醇、十一醛、1,2-二氯苯（纯度＞99%） 美国Sigma试剂有限公司；HCl、NaOH（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS仪 美国Agilent公司；65 μm DVB SPME纤维头 美国Supelco公司；STAR A111 pH计 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

采用文献[17]报道的方法制备酶解物和Maillard反应产物。称取一定量的方格星虫碎肉加入5 倍体积的去离子水，水浴（85 ℃）加热30 min后迅速冷却至室温。调节pH 9.0，按底物质量的3%加入碱性蛋白酶（20万 U/g），于50 ℃酶解120 min。然后，调节pH 6.5，加入等量的风味蛋白酶（3万 U/g），于50 ℃酶解120 min后，95 ℃灭酶10 min，迅速冷却至室温。酶解液离心（8 000 r/min、15 min），收集上清液（酶解物、SEH），冻干备用。分别称取一定量的冻干粉和4 种糖（冻干粉-糖质量比0.75∶1）溶于去离子水中，调节pH 6.8，制备SEH和不同糖的混合体系（70 g/L），于120 ℃反应120 min后，冰浴、冷却，于-20 ℃保存备用。形成的不同Maillard反应产物为：酶解物-葡萄糖（SEH-glucose，SEHG）、酶解物-麦芽糖（SEH-maltose，SEHM）、酶解物-木糖（SEH-xylose，SEHX）和酶解物-阿拉伯胶（SEH-acacia，SEHA）。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS测定

参考文献[2,18]进行测定。HS-SPME条件：取5 mL样品于10 mL SPME专用瓶中，加入内标1,2-二氯苯甲醇溶液（50 μg/mL），于55 ℃磁力搅拌加热20 min，再用250 ℃预老化30 min后的萃取头萃取30 min。

G C条件：D B-W A X毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；氦气（99.999%）流量1.0 mL/min；进样口温度230 ℃；柱温升温程序：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至230 ℃后保持5 min；采用不分流模式。萃取头解吸3 min后取出。

MS条件：电喷雾电离源，电子能量70 eV，离子阱温度150 ℃，GC-MS传输线温度250 ℃，质量扫描范围m/z 45～550，扫描速率0.220 s/scan。

1.3.3 挥发性风味成分的定性与定量

定性：采用NIST14.0谱库检索，选取结果匹配度大于80的化合物，并根据正构烷烃标准品C6～C33在相同条件下进行GC-MS分析并根据式（1）计算化合物的保留指数（retention index，RI）[19]，与报道文献值进行比对定性。

式中：tR（X）为待测化合物的保留时间；tR（Z）为碳原子数为n的正构烷烃保留时间；tR（Z+1）为碳原子数为n+1的正构烷烃保留时间；Z为碳原子数。

定量：采用内标法对挥发性成分进行定量[11]，根据式（2）计算化合物的浓度。

式中：Cx为挥发性化合物含量/（ng/g）；Cs为内标物含量/（ng/g）；Ax/As为化合物与内标物的色谱峰面积比值。

1.3.4 感官评价

参考文献[20-21]，并稍作修改。采用定量描述分析评价Maillard反应产物的感官特性。评价小组成员是由年龄在30～45之间食品专业的5 名男性和3 名女性组成。感官实验室符合GB/T 13868—2009《感官分析 建立感官分析实验室的一般导则基本信息》建设要求。实验开始前，评价员熟悉样品特性，并经充分讨论后，确定主要贡献的特征风味（焦糖味、泥土味、芳香味、苦味）。采用1～9 分制评价样品特征风味强度，对照组感官分值设为5 分。对照组样品设置如下：焦糖味（2.5 g熔融白糖+80 mL去离子水）、泥土味（5 mmol/L 1-辛烯-3-醇）、芳香味（5 mmol/L十一醛）、苦味（5 mmol/L咖啡因）。样品溶于0.5% NaCl中配制成质量分数为1%溶液，分别取60 mL样品和60 mL对照组样品置于40 ℃水浴中恒温10 min，防止温度差异干扰感官评价。采取随机取样进行感官评分。

1.4 数据处理

采用Origin 9.1软件对3 次重复实验数据进行统计分析并作图，P＜0.05，差异显著；采用SMICA-P 13.0对实验数据进行PCA、聚类分析，采用Origin 9.1进行PLSR分析。

2 结果与分析

2.1 4 种糖对Maillard反应产物挥发性风味成分的影响

不同Maillard反应产物的主要挥发性风味成分如表1所示。SEH主要含有13 种挥发性风味成分，其中醛类4 种（2 543.94 ng/g）、醇类3 种（860.55 ng/g）、酮类2 种（557.24 ng/g）、酯类2 种（343.48 ng/g）、呋喃类1 种（98.92 ng/g）和噻唑类1 种（374.05 ng/g）。SEH与不同糖发生Maillard反应后，SEHX（木糖体系）的主要挥发性风味成分种类增加至19 种，其中醛类14 种（6 291.98 ng/g）、醇类2 种（185.98 ng/g）、酮类1 种（279.37 ng/g）、酯类1 种（182.25 ng/g）和呋喃类1 种（46.90 ng/g）；然而，SEHG（葡萄糖体系）、SEHM（麦芽糖体系）和SEHA（阿拉伯胶体系）主要挥发性成分种类和含量较SEH均减少。

多数直链醛类物质成分是由不饱和脂肪酸氧化分解或者Strecker降解形成的，这类物质具有较低的风味阈值，产生较强的果香味、花香味和青草味等，对食品风味起主要贡献作用[16,22-23]。表1显示，SEHX的醛类物质种类（14 种）和含量（6 291.98 ng/g）较S E H（4 种，2 5 4 3.9 4 n g/g）均显著增大（P＜0.05），而其他组（SEHG、SEHM和SEHA）醛类物质种类和含量均减少；其中，3-甲基丁醛、壬醛和苯甲醛均存在于5 种样品中，经Maillard反应后，SEHX、SEHG和SEHM中的3-甲基丁醛（果香味）含量分别为1 196.09、129.52 ng/g和108.96 ng/g，较SEH（80.62 ng/g）显著增加（P＜0.05）；此外，SEHX中的壬醛含量（1 084.12 ng/g，甜橙味）较SEH（壬醛1 010.60 ng/g）显著增加（P＜0.05）；然而，其他组Maillard反应产物的壬醛和苯甲醛含量均显著低于SEH（P＜0.05），其含量大小表现为：SEHX＞SEH＞SEHM＞SEHG＞SEHA。与其他组醛类物质相比，SEHX增加了2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、庚醛、糠醛、十一醛、十二醛、十三醛、十四醛和十五醛，赋予产物果香味、花香味等特征风味[24]。结果表明不同糖对Maillard反应产物醛类物质影响较大，特别是木糖能够显著增加SEHX的醛类物质成分，这些物质成分能够直接或间接形成特征风味，改善产物的挥发性风味，例如，在一定条件下，壬醛与氨基酸或肽的氨基反应形成低风味阈值的杂环类化合物[16]。

在5 种样品中主要检测出4 种有风味特征的醇类物质成分，如表1所示。醇类物质来源于氨基酸还原和脂肪氧化等途径[25]，其不饱和醇类物质的特征风味阈值较低，具有果香味、花香味等。SEH中主要含有3 种醇类物质：桉油精、4-萜烯醇和1-壬醇，经Maillard反应后，4 种反应产物对应的醇类物质含量均显著减少或甚至消失，特别是风味阈值较低且具有泥土气味的4-萜烯醇含量（SEH含562.49 ng/g）显著减少，其中木糖和麦芽糖分别与SEH反应形成的SEHX和SEHM未检测出4-萜烯醇，而葡萄糖和阿拉伯胶与SEH反应形成的SEHG和SEHA检测出4-萜烯醇，且SEHG（272.98 ng/g）＞SEHA（69.5 ng/g）；另外，SEHG、SEHM和SEHX中均检测到正辛醇，含量分别为37.23、63.33 ng/g和124.12 ng/g，而SEH和SEHA中未检测出正辛醇；结果表明不同糖与SEH发生Maillard反应影响产物的醇类化合物形成。酮类化合物主要源于不饱和脂肪酸降解、氨基酸降解或醇类氧化[25]；SEH中形成具有特征风味的酮类化合物有6-甲基-5-庚烯-2-酮（96.15 ng/g）和(E)-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮（461.09 ng/g），与不同糖发生Maillard反应后，产物的酮类化合物含量减少，其中SEHX的酮类化合物含量最高（279.37 ng/g）。另外，SEH中检测出两种酯类化合物（果香味）：甲酸辛酯和苯甲酸乙酯，然而，不同Maillard反应产物的酯类物质只检测出苯甲酸乙酯，且含量较SEH显著减少（P＜0.05）。SEH中还检测出2-戊基呋喃（98.92 ng/g）和2-乙酰基噻唑（374.05 ng/g），其中2-戊基呋喃阈值较低（约6 ng/g），贡献了一定的蔬菜香和泥土香味[26]，经Maillard反应后，SEHX和SEHA中检测出2-戊基呋喃，含量分别为46.90 ng/g和29.73 ng/g，SEHG和SEHM中未检出；另外4 种Maillard反应产物均未检测出2-乙酰基噻唑化合物。以上结果表明，不同糖与SEH发生Maillard反应后影响产物挥发性风味物质的形成，其中木糖对Maillard反应体系的挥发性成分种类和含量的影响显著。

表1 不同Maillard反应产物的主要挥发性风味成分组成及含量Table 1 Volatile compounds and their concentrations in different Maillard reaction products

2.2 不同Maillard反应产物的感官特性分析

图1 不同Maillard反应产物的感官评分Fig. 1 Sensory scores of different Maillard reaction products

如图1所示，SEHX的焦糖味和芳香味得分最高，泥土味和苦味得分最低，而SEH的泥土味和苦味得分最高。焦糖味的形成归因于Maillard反应是在120 ℃进行，高温促进了焦糖化反应和碳水化合物降解，形成一些具有焦糖味特征的挥发性化合物。前期实验发现[17]，SEH与木糖Maillard反应体系褐变程度最大，其次是阿拉伯胶、麦芽糖，最后是葡萄糖，焦糖味的强度大小与Maillard反应程度一致。Maillard反应增强了体系的芳香味，其中，SEHX产生了大量具有果香味和花香味特征的醛类化合物（表1），显著增强了芳香味。另外，SEH中4-萜烯醇（562.49 ng/g）和2-戊基呋喃（98.92 ng/g）含量较高，贡献一定的泥土味。同时，SEH中含有大量的氨基酸和肽，其中疏水性氨基酸导致产物呈现苦味，经Maillard反应后，氨基酸或肽与糖相互作用形成Maillard反应产物，减少了游离氨基酸和肽的浓度，进而减轻了苦味；特别是，SEH与木糖Maillard反应强度高，大量消耗游离氨基酸或小肽，最大程度上减弱了苦味[19]。这与Chen Xiao等[21]研究发现Maillard反应减弱了蘑菇酶解液苦味，增强了Maillard产物焦糖味的结果一致。

2.3 不同Maillard反应产物与挥发性风味成分之间的相关性分析

图2 不同Maillard反应产物与挥发性风味成分之间的相关性Fig. 2 Correlations between different volatile compounds and Maillard reaction products

如图2所示，PC1的贡献率为82.97%，PC1和PC2的总贡献率为93.75%，表明PCA能较好地反映原始高维矩阵数据信息。根据5 种样品在图中的分布位置可知，SEHG、SEHM和SEHA位置分布聚集，表明这3 种样品在挥发性风味组成上差异不显著，而与SEH和SEHX的位置分布均存在明显偏离，表明它们在风味组成上差异显著。通过聚类分析（图3）发现5 种样品可以归为3 类，SEHG、SEHM和SEHA在风味组成上属于一类，SEH和SEHX归属为另外两类，与PCA结果一致。由图2可知，SEHX位于PCA图的右边，与醛类物质呈显著正相关，包括：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、己醛、庚醛、甲硫基丙醛、糠醛、苯甲醛、十一醛、苯乙醛、十三醛、十二醛、十四醛、十五醛，表明木糖与SEH形成的Maillard反应产物风味主要由具有果香味和花香味的醛类物质贡献。SEH位于PCA图的上端，与4-萜烯醇、1-壬醇、2-戊基呋喃、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲酸辛酯、2-乙酰基噻唑呈显著的正相关，特别是较高含量的4-萜烯醇（562.49 ng/g）、2-戊基呋喃（98.92 ng/g）赋予了SEH较浓烈的泥土味，与感官评分结果（图1）一致。SEHG、SEHM和SEHA均分布于PCA图第3象限（左下角），与己醛、十六醛和癸烯呈现显著的相关性。另外，SEHX中起主要贡献的风味化合物种类和含量显著高于其他组Maillard反应产物（SEHG、SEHM和SEHA），进一步证实了木糖与SEH形成的Maillard反应产物SEHX具有较好的风味特征和感官品质。

图3 不同Maillard反应产物的聚类分析图Fig. 3 Hierarchical cluster analysis of different Maillard reaction products

2.4 感官特性与挥发性风味成分之间的相关性分析

采用PLSR分析进一步考察感官特性与挥发性风味成分之间的相关性，建立PLSR模型计算回归系数确定哪些挥发性风味成分对感官特性有贡献。图4显示了泥土味、芳香味和焦糖味与挥发性风味成分之间的相关性。苦味主要与产物中的非挥发性物质（例如氨基酸、Maillard肽等）有关[27]，而受挥发性化合物的影响较小，因此未考察苦味与挥发性风味成分之间的回归分析。由图4A可知，泥土味与苯甲醛、桉油精、4-萜烯醇、1-壬醇、2-戊基呋喃、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲酸辛酯、2-乙酰基噻唑和苯甲酸乙酯呈现正相关，其中4-萜烯醇和2-戊基呋喃本身具有一定的泥土味、且阈值低，另外，在混合气味中6-甲基-5-庚烯-2-酮（果香味）具有增强泥土味的作用，这与PCA和感官分析的结果一致。由图4B可知，芳香味与2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、庚醛、甲硫基丙醛、糠醛、十一醛、苯乙醛、十三醛、十二醛、十四醛、十五醛和正辛醇呈现正相关，这与PCA得出的SEHX与醛类化合物呈现显著的相关性而形成芳香味的结论一致。由图4C可知，焦糖味与2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、庚醛、糠醛、十一醛、苯乙醛、十三醛、十二醛、十四醛、十五醛和2-戊基呋喃挥发性化合物呈现正相关；呋喃类化合物源于糖焦化或者碳水化合物降解，对焦糖味具有较大贡献作用[28]。比较发现形成芳香味和焦糖味差异的主要贡献挥发性化合物包括甲硫基丙醛、苯乙醛、正辛醇和2-戊基呋喃，其中前三者化合物增强了芳香味。尽管每种化合物独立存在时具有独特的风味（表1），但当不同挥发性化合物混合时可形成更加复杂的气味，感官风味源于不同风味特征的挥发性化合物之间相互作用形成的复杂气味[14]。这与Aprea等[13]研究水果挥发性风味时发现苹果香味是由不同风味特征的挥发性风味化合物混合形成的结论一致。

图4 感官特性与挥发性风味成分之间的回归系数分析Fig. 4 Regression coefficients between sensory attributes and volatile flavor components

3 结 论

采用HS-SPME-GC-MS联用和定量描述感官分析法探究SEH与不同糖形成的Maillard反应产物挥发性风味成分和感官特性变化及其相关性。结果表明，不同糖影响Maillard反应产物的醛类、醇类、酮类挥发性成分的种类和含量变化，特别是木糖能够显著增加SEHX的醛类成分的种类和含量，改善了产物的挥发性风味；Maillard反应减弱了酶解液的苦味和泥土味，且增强了反应产物的芳香味和焦糖味，其中以木糖改善效果最佳。聚类分析表明葡萄糖、麦芽糖和阿拉伯胶参与形成的Maillard反应产物（SEHG、SEHM和SEHA）属于同一类风味特征，但区别于木糖Maillard反应产物（SEHX）和酶解物（SEH）。PCA和PLSR分析表明SEHX，主要与醛类化合物呈现正相关，包括：2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、己醛、庚醛、甲硫基丙醛、糠醛、苯甲醛、十一醛、苯乙醛、十三醛、十二醛、十四醛、十五醛，SEHG、SEHM和SEHA与己醛、十六醛和癸烯化合物相关，贡献了一定的芳香味和焦糖味；SEH与4-萜烯醇、1-壬醇、2-戊基呋喃、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲酸辛酯、2-乙酰基噻唑呈现正相关，贡献了一定的泥土味；形成芳香味和焦糖味差异的主要贡献挥发性化合物包括甲硫基丙醛、苯乙醛、正辛醇和2-戊基呋喃，而对泥土味起主要贡献的化合物是4-萜烯醇、2-戊基呋喃和6-甲基-5-庚烯-2-酮。因此，不同糖显著影响Maillard反应产物的挥发性风味成分和感官特性，其中木糖对Maillard反应产物的风味特征和感官品质改善效果最佳。后续实验将进一步研究不同分子质量的酶解肽对Maillard反应特性及其产物挥发性风味成分的影响，为改善酶解物的风味和品质提供理论参考。