张 众，李 辉，张 静，薛 洁，张军翔,4,*

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.贺兰晴雪酒庄，宁夏 银川 750000；3.中国食品发酵工业研究院，北京 100015；4.宁夏大学葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

香气是评价葡萄酒品质的重要指标，葡萄酒香气主要包括品种香气、发酵香气和陈酿香气[1-2]。葡萄酒香气是多种因素共同作用的结果，包括葡萄品种、气候土壤、栽培模式、发酵工艺、陈酿环境等[3-4]。陈酿过程复杂，对于陈酿型葡萄酒来说，陈酿香气对整体香气的贡献较大。在陈酿过程中葡萄酒香气成分会发生缩合、聚合、水解、酯化、氧化、还原等反应，其中来自葡萄浆果的非挥发性糖苷前体物质的酸性水解、挥发性化合物种类和含量的变化以及进入葡萄酒中的橡木成分是影响葡萄酒陈酿香气的关键因素[2,5-9]。葡萄酒中的橡木成分主要包括糠醛、威士忌内脂、愈创木酚、丁香酚和香草醛等物质，它们赋予葡萄酒烟熏味、木质味、烘烤味等风味，同时也可以与葡萄酒原有的香气成分发生反应，从而影响葡萄酒的陈酿香气[10]。

橡木桶陈酿后葡萄酒需要进行瓶储，通过一定时期的瓶储，葡萄酒可以达到其最佳香气品质[5,8]。这是由于瓶储过程的微氧环境会对葡萄酒中的挥发性成分产生较大影响[8,11]。一方面，氧在Fe2+等金属离子的催化下与葡萄酒中的酚类物质反应促进醌和H2O2的生成，醌和H2O2能和含巯基的香气化合物发生反应；另一方面，H2O2和Fe2+通过芬顿反应生成羟自由基，能够氧化葡萄酒中一系列香气成分及其前体物质[5]。各种香气成分的变化会导致葡萄酒香气品质发生变化[12]。陶永胜等[13]通过对昌黎产区14 个年份的瓶储‘赤霞珠’干红葡萄酒进行感官分析，发现随着陈酿年份的推移，葡萄酒的香气品质先上升后下降，葡萄酒陈酿过程中香气的变化，也影响着葡萄酒的陈酿特性和潜力。近年，有关陈酿过程葡萄酒香气的研究在国内外都得到了重视，但由于获取多个连续年份的同款葡萄酒样品存在一定的困难，相关研究受到了一定的限制[5,8,11,13-16]。

宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区是我国乃至世界新兴的优质葡萄酒产区，能够生产出高品质的陈酿型干红葡萄酒，‘赤霞珠’是产区内主要栽培品种，但目前对其陈酿特性的研究较少。为了研究产区内‘赤霞珠’干红葡萄酒不同瓶储年份的香气成分和感官特征，本实验选取宁夏贺兰山东麓贺兰晴雪酒庄10 个不同年份的‘赤霞珠’干红葡萄酒作为酒样，利用顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法对酒样的香气成分进行定性定量分析，并对各年份酒样的香气特征进行感官评价，同时采用聚类分析和相关矩阵分析的方法比较‘赤霞珠’干红葡萄酒香气成分与年份和香气特征之间的关系，从而明确贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒香气的陈酿特征，为葡萄酒陈酿特性的研究提供参考，并为贺兰山东麓产区葡萄酒的宣传提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样：10 个年份的‘赤霞珠’干红葡萄酒由宁夏贺兰晴雪酒庄提供，分别为2005年份、2006年份、2008—2015年份（2007年份葡萄酒的品质达不到酒庄要求，故没有该年份的陈酿酒样）。用于酿酒的葡萄原料均采自同一葡萄园的同一地块，其中葡萄品种、栽培技术、管理模式、采收期、酿造工艺等前后保持一致。

无水乙醇（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；标准品：乙酸异戊酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、十一烷酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸里哪酯、癸酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己醇、壬醇、异丁醇、苯甲醇、苯乙醇、糠醛、苯甲醛、里哪醇、香茅醇、香叶醇、橙花叔醇、辛酸、癸酸、4-甲基-4-巯基-2-戊酮、丁香酚、愈创木酚 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Clarus 600型GC-MS仪（配有电子电离源）、Elite-Wax ETR色谱柱（30 m×0.25 mm，0.05 μm） 美国Perkin Elmer公司；SPME自动进样器、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酿造工艺

葡萄采收后进行除梗、破碎，然后泵入不锈钢发酵罐中冷浸渍3～5 d；乙醇发酵温度保持在25～30 ℃之间，乙醇发酵结束后皮渣分离，进行苹果酸-乳酸发酵，苹果酸-乳酸发酵结束后分离转罐并添加60 mg/L的SO2；将葡萄酒置于法国中度烘烤橡木桶中陈酿12 个月后，分离至不锈钢储酒罐中澄清、稳定，过滤后装瓶。葡萄酒装瓶后置于同一酒窖，在相同环境中进行瓶内陈酿（温度12～18 ℃，相对湿度60%～80%，酒窖早晚各通一次风）。取样和测样时间为2017年9月，每个年份酒样各取3 瓶，其中1 瓶用于理化指标测定和香气成分分析，另外2 瓶用于感官分析。

1.3.2 理化指标测定

乙醇体积分数、可滴定酸、pH值、干浸出物的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，总酚、单宁、总花色苷的测定参照文献[17]方法。

1.3.3 HS-SPME法提取香气

称取3 g NaCl于20 mL顶空瓶中，然后再加入5 mL稀释4 倍后的酒样，并添加20 μL的癸酸甲酯（280 mg/L，用色谱乙醇稀释）作为内标物，密封顶空瓶，45 ℃保温15 min后，45 ℃萃取40 min，然后GC进样，解吸温度230 ℃，解吸时间5 min。

1.3.4 GC-MS条件

参照文献[16]的分析条件和方法，对香气成分进行测定。GC条件：进样口温度230 ℃；载气高纯氦气（纯度≥99.999%）；流速1 mL/min，不分流进样，0.5 min前不分流，1 min后10∶1分流；程序升温：起始柱温40 ℃，恒温3 min，随后以3 ℃/min升温到230 ℃，并保持8 min。

M S条件：离子源温度2 3 0 ℃；传输线温度230 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z29～300。

1.3.5 定性与定量分析

根据标样的色谱保留时间和质谱结果，对比NIST 05标准谱库，对香气物质进行定性分析；以癸酸甲酯为内标，通过内标-标准曲线法进行定量，若香气物质没有相应的标样，则利用化学结构相似、碳原子数接近的原则进行定量[8]。

1.3.6 感官分析

感官品评小组由产区内10 名具有多年葡萄酒品尝经验的专家组成，年龄在28～46 岁之间，5 名男性，5 名女性。进行感官分析之前，小组成员进行为期一个月的葡萄酒标准香气物质（Le Nez du Vin，88香）的闻香培训。感官分析在宁夏葡萄与葡萄酒研究院标准品酒室中进行，采取盲品的方式，将10 个年份酒样以随机顺序进行品尝。要求品尝员从Davis香气轮盘和88香标准香气物质中选取合适的词汇进行香气特征描述，并参照国际葡萄与葡萄酒组织制定的百分制评价体系的评分标准对葡萄酒香气品质进行打分，香气评分依据见表1。

表1 香气感官分析评分Table 1 Wine aroma scoring

1.4 数据处理

采用Microsoft Office 2016和OriginPro 8软件进行基本数据处理和图表制作；采用R（3.4.1）统计分析软件pheatmap包进行香气成分聚类热图分析；采用R软件对感官数据进行单因素方差分析，Duncan进行多重比较，以检验不同年份葡萄酒香气品质是否存在显著差异；采用R软件ggcorrplot包绘制香气成分与香气得分的相关矩阵可视化图谱，并做出显著性分析。数据以 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 香气成分定性与定量分析

图1 10 个年份‘赤霞珠’干红葡萄酒香气成分相对含量Fig. 1 Percentages of various classes of aroma components in‘Cabernet Sauvignon' dry red wines from 10 vintages

经检测，10 个年份酒样乙醇体积分数范围在12.5%～15.2%之间，可滴定酸质量浓度为5.0～7.4 g/L，pH值范围为3.4～3.7，干浸出物质量浓度为29.8～37.6 g/L，总酚质量浓度为1.97～2.97 g/L，单宁质量浓度为1.65～2.86 g/L，总花色苷质量浓度为15.2～197.8 mg/L，各酒样理化指标属于正常范围。在此前提下，通过HS-SPME-GC-MS技术对10 个不同年份‘赤霞珠’干红葡萄酒的香气成分进行定性定量分析。表2列出了香气成分的含量、阈值以及香气特征。共定性并定量出32 种香气成分，根据其结构和特性可以分为酯类、醇类、萜烯类、酚类、酸类、醛类和巯基化合物共7 类物质。从表2可以看出，酯类物质种类最多，共15 种；其次是醇类和萜烯类，各5 种；酸类、醛类、酚类各2 种，巯基化合物1 种。各年份葡萄酒香气成分中酯类物质含量均最高，其次是醇类和酸类物质，醛类、萜烯类、酚类、巯基化合物在各年份酒样中含量均较低，与之前报道一致[15-16,18-19]。不同年份葡萄酒香气成分的含量存在较大差异，2011、2012、2014和2015等时间较短年份葡萄酒的香气成分总含量普遍低于2005、2006、2008、2009和2010等陈酿时间较长的葡萄酒，其中2009年份葡萄酒香气成分总含量最高，约为0.9 g/L，与前人的研究一致[20]。2013年份葡萄酒香气成分总含量偏高，这可能是由于该年份气候较为特殊所致。

表2 不同年份葡萄酒主要香气成分GC-MS分析结果及感官特征Table 2 Concentrations of main aroma components and sensory characteristics of wines from different vintages

如图1所示，各年份酒样的酯类物质比例均占到香气成分总含量的65%以上，醇类物质占13.30%～33.24%，酸类物质占0.43%～3.63%，其他4 类香气成分所占比例均低于0.28%。不同年份葡萄酒中各类香气成分含量存在差异，2009、2010年份葡萄酒中，酯类物质相对含量较高，醇类物质相对含量较低。酯类物质具有果香味，主要产生于发酵期间或陈酿期间，陈酿期间因酸性水解和氧化作用可能会转化为其他物质[2-3,25]；醇类物质来源于葡萄浆果或产生于乙醇发酵期间[26]，高级醇在质量浓度低于300 mg/L时能够增加葡萄酒香气的复杂度[2]。年份越久的葡萄酒中，酸类物质相对含量越高，其中脂肪酸在乙醇发酵期间由酵母菌代谢氨基酸和糖类物质产生，在陈酿期间由酯类物质水解产生，高浓度的脂肪酸具有不良风味如脂肪味[25-26]。年份越新的葡萄酒中醛类物质相对含量越高，这是由于新酒中含有较多的橡木成分如糠醛。糠醛是橡木桶制作过程中多糖热降解的产物[25]，具有焦糖味、木质味和烤面包味等气味特征[1]。与醛类相反，酚类物质（主要是愈创木酚和丁香酚等橡木成分）在老酒中的相对含量高于在新酒中的相对含量，具体原因有待探究。愈创木酚和丁香酚是橡木桶制作过程中木质素热降解的产物[10]，愈创木酚具有烟熏味、灰尘味和药物味的特征，丁香酚具有丁香花的香气[16,26]。不同年份葡萄酒中萜烯类物质和巯基化合物的相对含量差别较小（图1未显示），它们对葡萄酒香气的贡献也较大，如单萜类化合物具有果香和玫瑰花香的特征，陈酿环境能够促使多种萜烯类化合物水解，使葡萄酒香气更加丰富、浓郁、协调[9,25-26]。

2.2 陈酿葡萄酒的香气特征

2.2.1 不同年份酒样的主要香气成分

图2 10 个年份‘赤霞珠’干红葡萄酒中香气成分热图聚类分析Fig. 2 Cluster heat map analysis of aroma components of‘Cabernet Sauvignon' dry red wines from 10 vintages

利用R软件进行聚类热图分析，探究不同陈酿年份葡萄酒的主要香气成分，见图2。32 种香气成分聚为3 类：第1类香气成分含量在2005、2006、2008年份酒中含量较高，包括丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等15 种物质；第2类香气成分在2008—2010年份酒中含量较高，包括丁酸里哪酯、癸酸乙酯、壬醇等13 种物质；第3类香气成分含量在不同年份酒样中差异较大，包括乙酸异戊酯、糠醛、4-甲基-4-巯基-2-戊酮等4 种物质，其中，乙酸异戊酯具有果香味，即使在陈酿10 a以上的葡萄酒中也能明显地被感知[27]，4-甲基-4-巯基-2-戊酮属于巯基化合物，在葡萄酒中含量较低，但阈值同样较低，所以比较容易被感知[4,28-29]。根据图2可知，愈创木酚、丁香酚和糠醛在不同年份酒样中含量差别较大，它们由橡木桶进入到葡萄酒中，在瓶储较长年份的葡萄酒中也依然存在。

结合图1、2和表2可以看出，2013—2015年份葡萄酒中含量较高的成分主要具有花香、果香和植物味；随着年份的推移，大多数香气成分含量较高，葡萄酒的香气也会更加浓郁、复杂；但是在2005、2006年份和2008年份的葡萄酒中，异丁醇、辛酸和癸酸等高级醇和脂肪酸类物质含量较高，可能会影响葡萄酒的香气品质[15,22,25]。

2.2.2 葡萄酒香气的感官评价

表3 葡萄酒香气的感官评价Table 3 Sensory evaluation of wine aroma

对10 个年份‘赤霞珠’干红葡萄酒的香气进行感官评价，结果见表3。结果表明，2009—2015年份葡萄酒香气纯正度优于较早年份（2005、2006、2008年份）葡萄酒，并显著（P＜0.05）优于2008年份葡萄酒；2009、2010年份（陈酿7、8 a）葡萄酒香气浓郁度、优雅度以及总得分均优于其他年份葡萄酒；不同年份葡萄酒香气协调性差异不显著（P＞0.05）。结合图2可知，2009、2010年份葡萄酒的香气成分中，2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸里哪酯等酯类物质含量较高，高级醇（异丁醇）和脂肪酸（辛酸和癸酸）等具有不良风味的物质含量较低。从2015年份到2005年份，葡萄酒的香气特征由黑色水果味、植物味和烘烤味（橡木桶产生），向红色水果味、香料味、动物味、树脂味和泥土类气味转变。综上所述，陈酿7、8 a（2009、2010年份）的‘赤霞珠’干红葡萄酒的香气品质最高，主要具有黑色水果味、树脂味和香料味等特征。

2.3 香气成分与香气质量的相关分析

图3 ‘赤霞珠’干红葡萄酒香气成分与香气质量的相关矩阵Fig. 3 Correlation matrix of aroma components and aroma quality of‘Cabernet Sauvignon' dry red wine

利用R软件进行相关矩阵可视化以及显著性分析，以探究香气成分与香气质量的之间的关系，结果见图3。如图3所示，与葡萄酒香气浓郁度显著（P＜0.05）正相关的香气成分有乙酸乙酯、苯甲醛、丁酸里哪酯和乳酸乙酯，这些成分主要具有果香味、焦化味和坚果味的香气特征[1,18,23-24]。与香气优雅度和香气总分显著（P＜0.05）正相关的香气成分是乙酸乙酯，较低质量浓度的乙酸乙酯具有果香味，当其质量浓度超过200 mg/L时可能对葡萄酒香气质量产生不良影响[30]。庚酸乙酯对葡萄酒香气优雅度和香气总分具有显著（P＜0.05）的负面影响，异丁醇、苯乙醇、庚酸乙酯、己醇、癸酸和丁香酚与香气纯正度显著（P＜0.05）负相关，这些物质尤其是高级醇（异丁醇、苯乙醇、己醇）和脂肪酸（癸酸）含量降低将有利于改善葡萄酒的香气品质[2,18,25-26]。各种香气成分对葡萄酒香气协调性均无显著影响（P＞0.05），这是由于香气协调性是各类香气相互平衡的结果，而不只受个别香气成分的影响。此外，香气浓郁度和优雅度对香气总分贡献程度显著（P＜0.05），是重要的香气感官评价标准。

3 结 论

宁夏贺兰山东麓产区10 个年份的瓶储‘赤霞珠’干红葡萄酒中共定性鉴定出32 种香气成分，包括3 种挥发性橡木成分。各年份酒样的香气成分中，酯类物质含量最高，其次是醇类和酸类物质。热图聚类分析将32 种香气成分归为3 类：以酯类、醇类、萜烯类、酚类以及脂肪酸类物质为主的第1类香气成分在2005、2006、2008年份葡萄酒中含量较高；以酯类、醇类以及醛类物质为主的第2类香气成分在2008—2010年份酒中含量较高；第3类香气成分含量在不同年份葡萄酒中差异较大。感官分析结果表明，陈酿7、8 a（2009、2010年份）的葡萄酒香气质量最佳；从2015年份到2005年份，葡萄酒香气由黑色水果味、植物味和烘烤味，向红色水果味、香料味、动物味、树脂味和泥土类气味转变。相关矩阵可视化图谱显示，对贺兰山东麓‘赤霞珠’干红葡萄酒香气质量有显著（P＜0.05）贡献作用的成分分别为乙酸乙酯、苯甲醛、丁酸里哪酯和乳酸乙酯，有显著（P＜0.05）负面影响的成分分别为异丁醇、苯乙醇、庚酸乙酯、己醇、癸酸和丁香酚。