杨嵘晟, 朱俊芳, 冯树波

(1.巴音郭楞职业技术学院, 新疆 库尔勒 841000; 2.河北科技大学化学与制药工程学院, 河北 石家庄 050018)

大量微生物存在人类生活环境中，如日常用的家用电器、纤维服装、卫生陶瓷制品、塑料薄膜到建筑用的钢材、涂料以及饮用水等[1]，它们在适宜温度及养分下会迅速繁殖，导致物质的变质、腐败、发霉以及伤口化脓感染等，严重威胁人类健康。这就使得抗菌材料成为当今新材料研究和开发的热点之一[2]。超细无机抗菌材料是一种新型抗菌材料，与有机抗菌材料相比，具有广谱、耐久、安全等特点[3]。随着人们对环境质量要求的提高，无机抗菌材料具有广阔的市场前景。超细氧化锌作为无机抗菌材料之一，被广泛应用。学者对氧化锌抗菌性能的研究表明其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有很好的抗菌效果，而且对耐热、耐抗菌剂能力很强的枯草芽抱杆菌的孢子也具有较强作用，是一种广谱抗菌剂[4]。而单纯的超细氧化锌具有易团聚、难回收等缺点，为解决这一问题，许多研究者将超细无机物与有机物进行复合[5-6]，这样不仅可以节约超细无机物的用量成本，还可以将超细无机物进行回收，实现多次利用。

纤维素是地球上最丰富的天然产物，具有许多优异的性能，如可再生、生物相容性、高强度等[7-9]。纤维素气凝胶是将纤维素水凝胶冷冻干燥得到的多孔材料，具有丰富的多孔结构[10-11]，可作为许多无机物载体。将金属氧化物负载在气凝胶上，可以增加无机物的比表面积，而且有利于其回收，从而实现超细无机材料的再生利用。

本研究以医用脱脂棉为原料，通过交联法和冷冻干燥法制备了纤维素气凝胶，并将此作为支撑材料，通过溶剂热法制备超细氧化锌。利用超细氧化锌的抗菌性能和纤维素气凝胶的多孔结构，制备具有抗菌性能的复合气凝胶，利用抑菌圈法和抗菌率研究复合气凝胶的抗菌性能。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

医用脱脂棉，河南飘安集团有限公司；NaOH、尿素、环氧氯丙烷、无水乙醇、醋酸锌、乙二醇均为市售分析纯。菌种为大肠杆菌，康斯普瑞动物药业有限公司;培养基为琼脂培养基。

JSM-6490LV型扫描电子显微镜，日本电子公司；D8-Advance型X射线衍射(XRD)仪，德国Bruker公司；元素能量散射(EDS)仪，劳雷工业公司；Centriguge-5810 R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司。

1.2 样品制备

1.2.1纤维素多孔气凝胶的制备 参考文献[12]制备方法，称取2 g脱脂棉，浸泡在100 g 7% NaOH和12%尿素混合水溶液中，在-12 ℃下强力搅拌8 h，得到澄清的纤维素溶液。取纤维素溶液20 mL，加入2 mL环氧氯丙烷作为交联剂并搅拌均匀，将此纤维素溶液倒入模具中，保持溶液厚度为0.5 cm，密封后放入烘箱，50 ℃下交联反应1 h得到纤维素水凝胶。取出后水洗至溶液为中性，最后在-50 ℃下冷冻干燥24 h得到纤维素气凝胶。

1.2.2超细氧化锌的制备 取2.195 g Zn(CH3COO)2·2H2O置于250 mL烧杯中，加入100 mL乙二醇，油浴加热，冷凝回流，控制反应温度195 ℃，升温速率4 ℃/min，反应1.5 h。将得到的乳白色胶体以6 500 r/min离心20 min。离心后弃去上层液体，并用乙醇清洗沉淀。充分振荡后再次离心。弃去上层液体，剩余物在70 ℃干燥12 h，然后研磨成粉即得超细氧化锌。

1.2.3纤维素/超细氧化锌复合气凝胶的制备 分别取超细氧化锌0.005、 0.010、 0.015、 0.020 g分散到20 mL乙醇中，称取纤维素气凝胶各0.01 g分别放入上述不同质量浓度梯度的乙醇分散液中，搅拌24 h后取出。烘干后得到4种纤维素/超细氧化锌复合气凝胶。依次命名为CE/ZnO- 005、 CE/ZnO- 010、CE/ZnO- 015和CE/ZnO- 020。

1.3 样品表征

1.3.1纤维素气凝胶的表征 采用扫描电子显微镜对纤维素气凝胶、超细氧化锌、纤维素/超细氧化锌复合气凝胶进行观察，扫描电压15 kV，工作间距8 mm;通过EDS分析复合气凝胶表面样品组成成分及各元素的比例关系，操作条件为20 kV，2 000倍放大，15 mm 的工作间距;采用X射线衍射仪对纤维素气凝胶、超细氧化锌和复合气凝胶的晶型结构进行表征，操作条件为电压40 kV，电流100 mA，扫描范围10°～90°。

1.3.2复合气凝胶抗菌性能研究 将灭菌后的琼脂培养基倒入已灭菌的培养皿中，制成平板，然后取混合菌液(在琼脂培养基中添加5×10-5CFU/mL的悬浮细菌培养物50 μL)0.3 mL置于平板上，用刮刀涂布均匀。分别将纯纤维素气凝胶和4种不同的复合气凝胶，用刀切割，制成片剂(直径5 mm、厚度2 mm)，置于平板中央，再将培养皿置于30 ℃的恒温培养箱中，24 h后测定试样周围抑菌圈的大小，以抑菌圈直径作为评价材料抗菌性能的依据，定性地表征材料的抗菌性。

为了定量地测出复合气凝胶的灭菌率，采用菌落计数法[13]进行测定。以0.5 mL初始大肠杆菌菌悬液作为参比液，测出其中细菌的初始数量。然后在装有100 mL无菌水的锥形瓶中加入抗菌材料和0.5 mL的初始混合菌液，30 ℃恒温摇床培养12 h后，测量剩余的菌落数目，进而推断出活细菌总数，用灭菌率作为指标来定量评价材料的抗菌性能，灭菌率(R)[13]按式(1)计算。

R=(W0-Wt)/W0×100%

(1)

式中:W0—最初的大肠杆菌数量，个；Wt—灭菌后剩余的大肠杆菌数量，个。

2 结果与讨论

2.1 XRD分析表征

图1是 CE、 ZnO和CE/ZnO气凝胶的XRD图谱，从图中可以看出，纤维素在2θ=22.9°有明显的衍射峰，这是纤维素的特征衍射峰，氧化锌的7个主要特征衍射峰在图中都有显示(2θ=30.9°、 34.70°、 36.53°、 47.86°、 56.87°、 63.07°、 68.26°)[14]，并且峰形尖锐，说明结晶性良好。CE/ZnO复合气凝胶的XRD衍射峰除了具有氧化锌的7个明显的特征衍射峰外，在2θ=22.9°处也有纤维素的特征衍射峰，说明纤维素和氧化锌成功复合。

2.2 形貌分析

纤维素气凝胶的宏观形貌如图2所示，从图2(b)中可以看出气凝胶基底可弯曲，具有柔韧性。

图1 XRD图谱

a.平铺tiled; b.弯曲bended

超细氧化锌和纤维素气凝胶分别通过溶剂热法和冷冻干燥法制备，图3为超细氧化锌、纤维素气凝胶以及复合气凝胶的扫描电镜图。

a.ZnO, ×20 000; b.纤维素气凝胶CE aerogel, ×100; c.纤维素气凝胶表面surface of the CE aerogel, ×5 000; d.复合气凝胶表面surface of the CE/ZnO aerogel, ×5 000

图4 复合气凝胶元素能量散射图

由图3(a)可以看出，超细氧化锌直径大约为500 nm，呈球形结构，球形可以增加氧化锌的比表面积，使其能充分地与细菌接触。图3(b)为纤维素气凝胶结构，可以看出气凝胶内部呈三维网络多孔结构，这种多孔结构能提供更多的空间，有利于更多的超细氧化锌附着，从而更好地发挥超细氧化锌的抗菌效果。图3(c)为纤维素气凝胶表面放大图，由图可知纯纤维素气凝胶内部光滑，没有任何的颗粒附着在上面。图3(d)为纤维素/超细氧化锌复合气凝胶表面放大图，从图中可以看出气凝胶上有许多的纳米颗粒。在制备超细氧化锌时，使用乙二醇作为分散剂，使得超细氧化锌表面含有丰富的羟基，而纤维素分子结构中也有羟基的存在，纤维素和超细氧化锌就可以通过氢键进行复合。再结合元素能量散射图(图4)分析，这些颗粒主要为锌和氧元素，说明了ZnO的存在，图谱中也有碳元素的存在，说明是纤维素上的碳。再次证实了纤维素和氧化锌的成功复合。

2.3 抗菌性能研究

为了更直观地了解CE/ZnO复合气凝胶的抗菌性能，本研究利用测定抑菌圈的大小来评估复合气凝胶的抗菌效果，结果如图5所示。图5(a)中基本没有明显的抑菌圈存在，说明纯的纤维素气凝胶对大肠杆菌基本没有抗菌性，而图5(b)～5(e)中，可以看出明显的抑菌圈，并且随着氧化锌含量的增加，抑菌圈从0.12 cm增加到0.28 cm，说明在复合气凝胶中，氧化锌是主要的抗菌剂，氧化锌的用量越大越有利于抗菌。但ZnO用量过多会对纤维素气凝胶结构有一定影响，使纤维素气凝胶无法负载更多的ZnO，从而影响其抗菌效果。

a.纤维素气凝胶 CE aerogel; b.CE/ZnO- 005; c.CE/ZnO- 010; d.CE/ZnO- 015; e.CE/ZnO- 020

a.抗菌前before sterilization; b.加CE/ZnO- 020抗菌后after sterilization by CE/ZnO- 020

由图5可知，CE/ZnO- 020复合气凝胶的抗菌效果最为显著，故采用菌落计数法对CE/ZnO- 020复合气凝胶进行灭菌率测定，用来评价复合气凝胶的抗菌性能。图6可以清晰地看到抗菌前后细菌数量的变化，未抗菌的细菌培养基上含有大量的细菌，且分布均匀，而抗菌后的只存在少量细菌，通过菌落计数法计算得到CE/ZnO- 020对大肠杆菌的灭菌率为95.25%，说明纤维素/超细氧化锌复合气凝胶对大肠杆菌具有很好的抗菌性。

2.4 抗菌机理研究

氧化锌是传统的无机抗菌材料之一，细菌培养基中含有一定量的水，氧化锌在含水介质中可缓慢释放出Zn2+，细菌表面由于游离—COOH的存在而带负电荷，Zn2+凭借库仑引力被吸附到细菌表面，使细菌细胞膜受损，锌离子与蛋白质中的N和O元素络合，破坏酶蛋白分子的空间构象；或者是锌离子代替了激发酶活性的金属离子如Mg2+、Fe3+和Ca2+等，导致酶类变性从而达到抗菌目的[15-16]。在杀灭细菌后，锌离子可从细胞内游离出来，重复上述过程，这也是氧化锌抗菌性持久的原因。超细氧化锌除具有传统氧化锌的抗菌作用外，由于粒子粒径达到纳米级，具有纳米粒子特有的表面界面效应，体现在抗菌效果方面，纳米粒子的表面原子数量大大多于传统粒子，表面原子由于缺少邻近的配位原子而具备很高能量，可增强氧化锌与细菌的亲和力，提高抗菌的效率[17]。将超细氧化锌与纤维素气凝胶复合，由于纤维素属于有机天然产物，它能使细菌更容易与抗菌剂接触，吸引细菌在纤维素气凝胶附近生长，使氧化锌能更好地接触细菌，将其杀灭，可以更充分地发挥超细氧化锌的抗菌性。

3 结 论

以溶液交联法和冷冻干燥法制备的纤维素气凝胶为载体，溶剂热法制备的超细氧化锌作为抗菌剂，通过浸泡法制备了纤维素/超细氧化锌(CE/ZnO)复合气凝胶抗菌剂，并对其进行结构表征和抗菌性能分析，XRD图和SEM图证明研究成功制备了CE/ZnO复合气凝胶，且其具有很好的三维网络多孔结构。CE/ZnO复合气凝胶具有很好的抗菌性能，并随着氧化锌的含量的增加其抗菌性能也在增加，纤维素气凝胶和超细氧化锌质量比1∶2制备的复合气凝胶CE/ZnO- 020对大肠杆菌的灭菌率达到95.25%。