姚 婷，谢惠林，邓胜国,，赵雅倩，董加宝*

(1.湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南 永州 425199；2.江华县同泰中药饮片有限公司，湖南 江华 425500)

月桂(Laurus nobilis L.)是樟科月桂属亚热带树种，原产于地中海沿岸，我国的江苏、浙江、四川、山东、陕西、福建及云南等省有大量栽培。月桂叶中含有多糖类、多酚类化合物、氨基酸、粗蛋白、粗纤维、有机酸、维生素、矿质元素、萜类和黄酮类化合物等。目前国内外文献中月桂叶中挥发油和黄酮类研究较多，其他成分的研究较少[1-3]。月桂叶水提物可作为止泻剂，用于肠胃疾病的治疗[4-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：永州本地月桂叶于2019年3月25日采自湖南科技学院逸夫楼前，洗净、晾干、干燥、粉碎、过筛，保存备用。

试剂：无水乙醇、95%乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖均为分析纯。

1.2 主要仪器

AY220型电子分析天平；722型紫外可见分光光度计；DF-101S型集热式磁力搅拌器；CN61M/F120型植物粉碎机；WG-71电热恒温鼓风干燥箱，SHZ-D(III)循环水式多用真空泵；ZLS-2离心机。

2 方法

2.1 葡萄糖标准曲线测定及多糖含量测定

葡萄糖标准曲线测定及多糖含量测定按照文献[7]进行。

月桂叶中多糖提取得率 = CNV/m

式中，C为样品稀释液的多糖浓度(mg/mL)；N为稀释倍数；V为最初样品定容体积(mL)；m为月桂叶的质量(g)。

2.2 单因素试验

精确称取月桂叶粉约5.0 g 置于250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL的无水乙醇回流1 h，过滤，得到滤渣。

向滤渣中加入一定量的蒸馏水，在一定温度下回流一定时间，滤液于25 mL容量瓶中定容，取1 mL定容液在100 mL容量瓶中，再次定容，制得样品稀释液。研究提取温度、提取时间、液料比、提取次数四个因素对月桂叶多糖提取得率的影响。

2.2.1 提取温度的影响

5.0 g月桂叶粉无水乙醇回流后滤渣，固定水料比16∶1，水浸取时间1 h，研究提取温度为50、60、70、80、90、99℃时对多糖提取得率的影响。

2.2.2 提取时间的影响

5.0 g月桂叶粉无水乙醇回流后滤渣，固定水浸取温度为80℃，水料比16∶1，研究提取时间为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h时对多糖提取得率的影响。

2.2.3 料液比的影响

5.0 g月桂叶粉无水乙醇回流后滤渣，固定水浸提温度80℃，水浸提时间1 h，研究液料比为8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1 时对多糖提取得率的影响。

以上试验均设3个平行组，求平均值。

2.3 提取工艺优化的响应面试验设计

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素影响试验结果，选取提取温度，提取时间，料液比3个因素，每个因素选择3个水平，按响应面安排试验，以多糖得率作为提取效果的指标，分析试验结果，优选最佳提取工艺，得到月桂叶多糖响应面提取的最佳工艺[8-9]，试验因素水平编码见表1。

表1 试验因素水平表

2.4 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6软件对所有试验数据进行分析。

3 结果与分析

3.1 月桂叶多糖提取的单因素试验

3.1.1 提取温度对月桂叶多糖得率的影响

提取温度对月桂叶多糖得率的影响如图1所示。随温度的升高，多糖提取率不断增加，到达80℃基本不再增加，趋于平缓，在90℃后多糖得率更有下降，可能是因为较高温度破坏了部分浸出的多糖，蛋白质等杂质的析出也将增加，从而使多糖的提取量略有降低。随着温度的升高，多糖色泽加深，考虑到高温可能对多糖的结构与活性有一定影响，温度过高多糖易产生降解，而且温度过高，水分容易挥发，给操作带来不便，所以选择80℃作为提取的最佳温度。

图1 提取温度对月桂叶多糖得率的影响

3.1.2 提取时间对月桂叶多糖得率的影响

提取时间对月桂叶多糖得率的影响如图2所示。随着加热时间的延长可以促进多糖的溶解，2 h后提取率基本保持不变。随着提取时间的延长，热水可能致使月桂叶原料中大分子多糖分解，导致多糖提取量略有下降。此外，提取时间过长还会使溶解的杂质增多，使多糖的纯度降低，同时加热时间若过长，能耗明显要增加，从节约能源、减少生产周期考虑，故选择2 h作为最佳提取时间。

图2 提取时间对月桂叶多糖得率的影响

3.1.3 液料比对月桂叶多糖得率的影响

图3 液料比对月桂叶多糖得率的影响

液料比对月桂叶多糖得率的影响如图3所示。随液料比的增大，多糖得率有提高的的趋势，当液料比等于16∶1时多糖得率最高，然而，当液料比大于16∶1时，多糖得率呈下降趋势。这可能是因为当溶剂量不足时，多糖提取不充分，导致多糖得率较低。当溶剂剂量过多时，会使其他杂质同时溶出，从而影响月桂叶多糖的溶出，使得实验准确性降低，从而影响多糖得率。因此，选取液料比为16∶1左右最佳。

3.2 月桂叶提取工艺的响应面优化

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0.6软件，以月桂叶多糖提取得率为响应值，以提取温度(A)、提取时间(B)、液料比(C)3个因素为自变量，建立三因素三水平中心组合试验，共17个试验方案，试验结果见表2。

表2 提取率响应面试验方案及结果

3.3 回归方程的建立

采用Design expert 8.0.6对表中试验结果进行多项模回归，得到月桂叶提取时间(B)、液料比(C)的二次多项模拟方程：

Y=1.47+0.47A-0.42B-1.17C+0.24AB-0.21AC+0.64BC-2.09A2-0.68B2-2.94C2

为了更好的验证本实验回归方程的实用性，同时也为了更好的确定各因素对月桂叶多糖得率的影响程度，对回归模型进行方差分析，结果表3。由方差分析可知:模型的F=118.54模型的显著水平p小于0.0001，远小于0.01，表明实验所采用的二次多项模型是极显著的，在统计学上是有意义的[10]。该实验方法是可行的。用失拟项来表示所选用模型与实验拟合的程度，即二者的差异程度。本实验的失拟项的P值为0.0514>0.05，不显著，对模型是有利的，没有失拟因素存在，所以可以用方程代替试验真实点对实验结果进行分析。该模型的决定系数R2=0.9851。也说明该模型能够较好的反应响应值的变化，拟合度好。各因素的效应关系为PA、PB、PC、PA2、PB2、PC2、PBC均小于0.05，说明提取温度、提取时间、液料比3个因素的二次项以及提取时间与液料比的交互项都有显著影响。

表3 回归模拟方差分析

注：**P<0.01为极显著；*P<0.05为显著。

3.4 各因素的交互作用分析

各因素的交互作用如图5所示。由图5可以分析得出各个因素对月桂叶多糖得率的影响程度[8]。从3张图对比之下我们可以很直观得分析得出：3个因素中液料比月桂叶多糖得率的影响最大，表现为各个因素之间的交互作用中有液料比的，响应曲面表现较陡峭，再由液料比与提取温度的交互作用影响图和液料比与提取时间交互作用影响图进行比较可以很直观得看出图液料比与提取温度的交互作用响应曲面较陡，从而得出提取温度比提取时间对月桂叶多糖的得率影响更大。再从表3中的F值中也能得到验证这3种因素影响程度大小顺序分别为:C(液料比)>A(提取温度)>B提取时间。

图5 各因素之间交互作用影响以及月桂叶多糖得率的响应曲面

3.5 优化工艺验证试验

运用Design expert8.0.6软件对二次多项式回归方程进行计算，得到最佳的月桂叶多糖提取条件为：温度82.65℃,提取时间1.89 h，液料比15.35∶1，多糖得率预测值为1.4656%。但考虑到实际操作的局限性，把月桂叶多糖提取工艺修正为：提取温度82℃，提取时间1.9 h，液料比16∶1，在修正条件下进行了3次平行验证实验可达到月桂叶多糖得率平均值为1.46%。与模型预测值相差不大，具有使用价值。多糖得率见表4。

表4 最佳提取条件及其验证

4 结论

本实验根据单因素试验数据分析最终得到月桂叶多糖的提取条件，结果表明月桂叶多糖提取工艺参数为：温度80℃，提取时间2 h，液料比16∶1,在此工艺下得到月桂叶多糖含量结果最佳。由响应面分析中的方差分析以及各因素交互作用可知，影响月桂叶多糖提取条件因素主次顺序C(液料比)>A(提取温度)>B提取时间；建立了多糖得率的回归模型，由该模型优化的多糖最佳提取工艺条件为：温度82℃，提取时间1.9 h，液料比16∶1,在此条件下得到月桂叶多糖含量为1.46%。