郑佳东，周培培，戚玉若，官若楚，栾璐璐，付丽娜

(黄河科技学院 医学院，河南 郑州 450063)

黑木耳(Auricularia auricula)又称云耳，是药食两用的大型真菌[1]。黄酮是黑木耳中主要活性成分，具有抗凝血、降血脂等多种功效，在医药和食品领域显示出良好的应用前景[2]。超声波辅助提取植物中有效成分的技术已被广泛应用，具有提取率高、提取时间短等优点。试验以黑木耳为研究对象，利用超声波辅助方法提取黑木耳黄酮，设计单因素试验，以料液比、超声温度、超声功率及乙醇浓度为考察因素，通过正交试验优化黑木耳黄酮的提取条件，为深度开发利用黑木耳资源提供科学依据[3]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳干品(产地：黑龙江牡丹江市)，芦丁标准品(北京化学试剂公司)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇等试剂购于天津市科密欧化学试剂有限公司，所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器

TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；FA1004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；XFB-200型粉碎机：吉首市中诚制药机械厂；3号药典筛(孔径0.36 mm，50目)、5号药典筛(孔径0.18 mm，80目)：浙江上虞市五四仪器筛具厂；SHZ-D(Ш)循环水式多用真空泵：邦西仪器科技(上海)有限公司；远红外鼓风干燥箱：天津市华北实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳的预处理

将黑木耳洗净，晾干，于烘箱中55℃干燥至恒重，粉碎，先后过3号和5号药典筛、装瓶备用[4]。

1.3.2 绘制芦丁标准曲线

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

精密称取干燥至恒重的芦丁标准品25 mg，置50 mL容量瓶，加75%的乙醇定容，摇匀，得0.5 mg/mL芦丁标准溶液，精密移取标准溶液0、1、2、3、4、5、6和7 mL分别放置于100 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL和10%Al(NO3)3溶液1mL，摇匀，之后加4%NaOH溶液10 mL，定容，摇匀，静置15 min，用紫外可见分光光度计510 nm处测定吸光度A[5]。以芦丁浓度为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=0.7605X+0.0574 ，R2=0.9993，说明线性关系良好。

1.3.3 黄酮类化合物的测定

精密称取2.0000 g干燥至恒重的黑木耳粉末，设置料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL)用(50%、60%、70%、80%、90%)乙醇溶解，定容，摇匀，于功率(50、60、70、80、90 W)、温度(40、50、60、70、80℃)条件下超声处理，冷却，抽滤，将滤液转移到50 mL容量瓶中定容，摇匀，移取10 mL分别放置于50 mL容量瓶中，然后加5%NaNO2溶液1 mL和10%Al(NO3)3溶液1 mL，静置10 min，摇匀，加入4%NaOH溶液10 mL定容，摇匀，静置15 min，于紫外可见分光光度计510 nm处测定吸光度A[6]。

1.3.4 黑木耳黄酮类化合物的测定

采用NaNO2-Al (NO3)3显色法，测定提取液中黄酮类化合物的含量。

黄酮提取率%=C×V×N×100/M；其中，式中，C为提取液质量浓度(mg/mL)；V为定容体积(mL)；N 为稀释倍数；M 为粉末质量(mg)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 最佳料液比的确定

固定温度60℃、功率100 W、乙醇浓度80%，设置料液比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)5个水平，按照1.3.3方法测定黑木耳中黄酮的提取率，结果如图2。

图2 料液比对黑木耳黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liqiud rate on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

由图2得出，随着料液比的增加黄酮提取率出现逐渐升高然后降低的趋势。可能是因为溶剂量太少时，黄酮的溶出量较少，之后慢慢增加，但溶剂量过大时杂质的溶出也会增加，导致提取率降低[7]，因此将最佳料液比确定为1∶6。

2.1.2 超声温度的选择

固定料液比1∶6、功率100 W、乙醇浓度80%，设置超声温度分别为40、50、60、70、80℃共5个水平，按照1.3.3方法测定黑木耳中黄酮的提取率，结果如图3。

从图3可知，随温度的升高黄酮提取率不断升高，在60℃时提取率最高，之后提取率出现下降的趋势，这可能是由于提取温度过高时，黄酮类化合物的结构受到破坏，因此选择60℃为提取黑木耳黄酮的最佳温度[8]。

图3 超声温度对黑木耳黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

2.1.3 超声功率的选择

固定料液比1∶6、温度60℃、乙醇浓度80%，设置超声温度分别为50、60、70、80、90 W共5个水平，按照1.3.3方法测定黑木耳中黄酮的提取率，结果如图4。

图4 超声功率对黑木耳黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

从图4可以看出，黄酮的提取率随着超声功率的增加而升高，在超声功率为80 W时提取率最高，超声功率超过80 W时提取率明显减少，因此将最佳超声功率确定为80 W。

2.1.4 乙醇浓度的选择

图5 乙醇浓度对黑木耳黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

固定料液比1∶6、温度60℃、功率80 W，设置超声温度分别为50%、60%、70%、80%、90%共5个水平，按照1.3.3方法测定黑木耳中黄酮的提取率，结果如图5。

从图5看出，随着乙醇浓度的增加黄酮的提取率也在不断增加，在乙醇浓度为80%时提取率达到最高，而后出现下降的趋势，所以选择最佳超声功率为80%。

2.2 正交试验

表1 正交试验结果表Table 1 Orthogonal experiment results and analysis table

对表1的数据进行分析，影响黄酮提取率的因素顺序依次是乙醇浓度、超声功率、温度、料液比，其中乙醇浓度对黄酮提取率的影响最大。从表中的极差值分析出最佳提取条件为∶料液比1∶6、温度70℃、功率70 W、乙醇浓度75%。

2.3 验证试验

表2 验证试验结果Table 2 Verification testing results

为了验证正交试验结果，在最佳提取条件下进行三次平行试验，即料液比1∶6(g/mL)、超声温度70℃、超声功率70 W、乙醇浓度75%(表2)，得到平均提取率为0.92%，RSD=1.081%，结果显示离散程度小，即精密度高、结果重现性好。

3 结论

通过单因素试验考察料液比、超声温度、超声功率、乙醇浓度对黑木耳中黄酮提取率的影响，并设计正交试验优化提取工艺，最终确定超声波辅助提取黑木耳黄酮的最佳条件为：料液比1∶6(g/mL)、超声温度70℃、超声功率70 W、乙醇浓度75%，提取率为0.92%。在该提取工艺条件下黄酮提取率较高，利用超声波辅助提取方法减少了资源消耗，节省了时间，该项研究为进一步开发黑木耳资源提供了科学依据。