沈 莹， 柳湘洁， 雷 超， 曾永孝， 艾 娟， 谭婉燕

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院1老年病科，2消化内科， 湖北 武汉 430077)

细胞自噬是细胞受到刺激后，通过溶酶体途径降解细胞内物质，从而实现细胞本身代谢需要和某些细胞器更新的过程[1]。它既可以作为一种防御机制，清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚细胞水平上的重构，保护受损细胞，同时也可以作为一种细胞死亡程序，诱导细胞主动性死亡。自噬的调节是一个非常复杂的过程，许多信号通路包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/PI3K、beclin-1及Ca2+等都参与其中。mTOR是氨基酸和ATP的感受器，在自噬过程中发挥着门控作用，其活性是自噬体形成与成熟的关键[2]。

黄芪是一种传统补中益气药，具有增强及调节免疫、调节细胞因子分泌以及清除自由基等功能[3]。黄芪苷中的有效成分黄芪甲苷(astragalosides)具有抗应激功效，可以在一定程度上减轻和消除应激对机体生理机能的影响[4-6]。研究表明，黄芪甲苷能减少PC12细胞氧糖剥夺后再复糖复氧诱导的细胞自噬[5]。但是，黄芪总苷对H2O2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤引起的细胞自噬的调节作用尚未明确，所以本研究以此为切入点，观察黄芪总苷对H2O2诱导的心肌细胞自噬的影响，为其合理应用提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 细胞、主要试剂及仪器

大鼠心肌H9c2细胞购于中国科学院细胞库，为H9c2(2-1)细胞株，这个细胞系具有许多骨骼肌的特性，成肌细胞能融合形成多核的肌管，并对乙酰胆碱的刺激发生反应，如果培养液中的血清浓度下降到1%，融合发生得很快。流式细胞仪购自BECKMAN；全自动化学发光分析仪购自上海天能公司。DMEM购自HyClone；胎牛血清购自Gibco；吖啶橙荧光染色试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒以及BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自Bioswamp。兔抗鼠mTOR、p-mTOR、P70S6K、LC3-I、LC3-II、caspase-3、GAPDH和羊抗兔IgG均购自Abcam；黄芪总苷4瓶，规格为20 mg，雷帕霉素4瓶，规格为20 mg，均购自湖北威德利化学科技有限公司。

2 主要方法

2.1体外培养大鼠心肌H9c2细胞 大鼠心肌H9c2细胞加入含10%胎牛血清的培养液于75 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，3～5 d进行换液，吸去旧培养液，加入1 mL含0.25%胰酶消化，显微镜下观察到细胞脱壁后立即加入3 mL完全培养液终止消化。将培养液转入15 mL离心管内，252×g离心3 min，速度离心后去除上清液，加入6 mL葡萄糖(浓度4.5 g/L)并添加含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，吸管反复吹打成细胞悬液。使用血细胞计数仪计数后，以每孔1×105的密度接种在6孔板中继续培养。

2.2建立细胞模型及细胞分组[7]待细胞贴壁生长融合50%～60%时，随机分成4组进行实验。实验具体分组如下：(1)正常(normal)组：采用含4.5 g/L葡萄糖并添加10%胎牛血清的DMEM继续培养；(2)模型(model)组：在DMEM中加入200 μmol/L H2O2；(3)黄芪总苷组：在含4.5 g/L葡萄糖并添加10%胎牛血清的DMEM中同时加入200 μmol/L的H2O2和20 mg/L的黄芪总苷[8]；(4)雷帕霉素(rapamycin)组：在含4.5 g/L葡萄糖并添加10%胎牛血清的DMEM中同时加入200 μmol/L的H2O2和0.1 mg/L的雷帕霉素。各组均处理8 h。

2.3流式细胞技术检测细胞凋亡率 H2O2诱导大鼠心肌H9c2细胞损伤结束后，消化离心制成单细胞悬液，4 ℃遇冷的70%乙醇固定，上流式细胞仪检测前去掉固定液，PBS清洗，加入DNA染料，碘化丙啶染色，室温避光孵育20 min，采用Cell Quest软件获取细胞信号，并进行细胞凋亡率分析。

2.4吖啶橙染色观察细胞自噬程度 采用吖啶橙荧光染色试剂盒完成吖啶橙荧光染色。根据试剂盒说明书步骤操作如下：收集细胞，用吖啶橙染剂AO Stain Buffer(1×)清洗细胞1次，加入适量的1倍的吖啶橙染剂AO Stain Buffer(1×)重悬细胞，计数并调节细胞浓度至1×109/L。取适量的细胞悬液和吖啶橙染剂，按照细胞悬液和5 μL吖啶橙染剂为19∶1的比例混合，轻轻混匀。室温避光染色15 min。滴加于载玻片上并加盖玻片，荧光显微镜下观察细胞凋亡程度，并拍照。

2.5Western blot分析 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解细胞，每5 min振荡1次，裂解20 min，4 ℃、13 700×g离心30 min，吸取上清液获取总蛋白。根据BCA蛋白定量结果上样，10% SDS-PAGE 2.5 h，转膜后NC膜TBS稍荡洗，5% 脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃下分别孵育p-mTOR、mTOR、P70S6K、caspase-3和LC3 I抗过夜，TBST洗3次，每次10 min,室温孵育II抗1 h，TBST洗10 min，重复3次，曝光显影；采用 BIO-RAD Image Lab 软件进行灰度值分析。

3 统计学处理

使用SPSS 17.0软件处理数据，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 黄芪总苷抑制H9c2细胞凋亡

流式细胞术结果显示，模型组的大鼠心肌H9c2细胞凋亡率为34.5%，显著高于正常组的3.36%(P<0.05)；黄芪总苷组的细胞凋亡率为7.79%，显著低于模型组和雷帕霉素组(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The apoptotic rate of rat H9c2 cardiomyocytes in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05 vs model group.

图1 大鼠心肌H9c2细胞凋亡率

2 黄芪总苷抑制H9c2细胞自噬

正常组和黄芪总苷组的大鼠心肌H9c2细胞形态完整，细胞核染色为绿色荧光，染色质分布均匀，细胞形状规则；而模型组和雷帕霉素组细胞出现不规则橘黄色自噬泡，染色质凝聚、分块，细胞质皱缩，细胞表现出自噬特征，见图2。

3 p-mTOR/mTOR、P70S6K、自噬蛋白LC3和凋亡相关蛋白caspase-3的表达

Western blot检测显示，与正常组比较，模型组大鼠心肌H9c2细胞的p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组和雷帕霉素组比较，黄芪总苷组的大鼠心肌H9c2细胞p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白表达显著增加(P<0.05)；各组大鼠心肌H9c2细胞mTOR蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)，见图3。

与对照组比较，模型组的大鼠心肌H9c2细胞LC3-II/LC3-I及cleaved caspase-3表达均显著增加(P<0.05)；与模型组和雷帕霉素组比较，黄芪总苷组的大鼠心肌H9c2细胞LC3-II/LC3-I及cleaved caspase-3的相对表达量显著降低(P<0.05)，见图3。

Figure 2.Autophagy of rat H9c2 cardiomyocytes in each group observed using acridine orange fluorescence method (×200).

图2 吖啶橙染色法检测各组大鼠心肌H9c2细胞自噬

讨 论

LC3是自噬相关基因8(autophagy-related gene 8, Atg8)的同源物，是自噬体的标志分子[9]，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小可以在一定程度上反映自噬体的数量和细胞自噬水平的高低[10-11]。caspase-3则是细胞凋亡早期阶段激活的关键蛋白酶，它的激活可以作为判断细胞凋亡严重性的可靠指标之一。若抑制caspase-3蛋白的激活表达，则可显著减轻凋亡的产生。本研究结果显示，与模型组和雷帕霉素组相比，黄芪总苷组大鼠心肌H9c2细胞的LC3-II/LC3-I和caspase-3蛋白表达显著下调，心肌细胞的自噬是被抑制的，细胞凋亡程度较低，说明黄芪总苷对H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞损伤具有保护作用，能够抑制细胞自噬，显著提高心肌细胞存活率，降低心肌细胞凋亡程度。有研究表明，黄芪苷Ⅳ可以通过PI3K/Akt信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤[6]；黄芪总苷提取物能够抑制心肌缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡[12]；黄芪多糖能通过提高心肌细胞存活率、改善抗氧化酶活性、抑制细胞凋亡，从而对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤起保护作用[13]。本研究得出的结论与上述已有研究结论一致。

Figure 3.Western blot was used to detect the protein expression in rat H9c2 cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

图3 Western blot检测各组大鼠心肌H9c2细胞中相关蛋白的表达

mTOR信号通路是细胞内重要的信号途径，对于细胞的生长、增殖、分化和凋亡等生理过程起着中心调控点的作用[14-15]。P70S6K是mTOR下游信号之一，mTOR主要通过磷酸化其下游靶蛋白P70S6K来调节mRNA转录和翻译的信号通路[16]。本实验结果显示，与模型组和雷帕霉素组比较，黄芪总苷组的大鼠心肌H9c2细胞p-mTOR蛋白和P70S6K蛋白表达显著增加，提示黄芪总苷可增加p-mTOR和P70S6K的生成，从而抑制细胞自噬。这说明黄芪总苷可通过介导mTOR信号通路抑制H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞自噬。

在缺血缺氧等饥饿状态下，自噬的发生主要由mTOR通路调控。缺氧的信号使mTOR信号通路失活，从而激活自噬信号通路[2]。雷帕霉素是mTOR通路的抑制剂，可抑制mTOR磷酸化，诱导和促进细胞自噬的发生[17]。本研究中黄芪总苷促进了H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞中mTOR的磷酸化，激活了mTOR信号通路，抑制细胞自噬，降低凋亡，起到了保护心肌细胞免于损伤的作用。这与诱导心肌细胞磷酸化其下游靶蛋白P70S6K，能够显著抵抗心肌细胞缺氧/复氧损伤[18]的结论是一致的。

综上所述，黄芪总苷可能通过mTOR信号通路抑制H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞自噬，减少心肌细胞凋亡。