傅金萍 朱飞

(安徽医科大学第一附属医院整形外科，安徽 合肥 230022)

自体脂肪颗粒作为一种软组织填充材料在整形美容外科应用多年，但自体脂肪颗粒移植因低存活率、高吸收率及多并发症使其在临床进一步发展中受到限制〔1〕。因此大量学者试图通过改善抽吸方式、脂肪移植获取部位、注射移植、处理环节等方面的技术提高脂肪移植的存活率，但脂肪移植后坏死、吸收、液化等并发症仍存在，使脂肪移植的存活率不稳定〔2〕。血管再生在脂肪移植中发挥重要作用，提高移植脂肪组织早期血管再生对提高脂肪移植的存活率具有重要意义〔3〕。基质血管碎片凝胶(SVF-GEL)为一种新型的脂肪组织来源的干细胞凝胶，富含血管内皮细胞、脂肪干细胞和其他细胞等，具有促进创伤愈合的作用〔4〕；SVF-GEL还可有效逆转胶原流失、皮肤衰老等带来的黑眼圈、颈纹、眼周细纹、口周细纹等，可改善皮肤质地，促进皮肤年轻化。本文将SVF-GEL联合脂肪颗粒进行脂肪移植，观察SVF-GEL对脂肪移植存活率的影响。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：健康、清洁级、体重22～24 g、7～9周龄、雄性、BALB/c裸鼠96只，购自马鞍山丰原制药有限公司，许可证号：SYXK(皖)2016-002。脂肪收集：从健康、没有系统性疾病、要求抽脂塑身的女性大腿内侧抽吸脂肪组织，受试者签署知情同意书，该研究通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会审批。主要试剂：酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Abcam公司)，兔抗大鼠CD34多克隆抗体、兔抗大鼠Perilipin A多克隆抗体、Cy3标记山羊抗兔抗体、山羊抗兔IgG抗体(美国Gibco公司)等。

1.2SVF-GEL制备：采用20 ml注射器连接抽吸针头抽取受试者大腿内侧脂肪组织，放入20 ml注射器中，放置在支架上静置10 min，脂肪分为三层，放掉最下层血水混合物，再放掉血，留上层脂肪组织，将装有脂肪的注射器放入离心机中离心(1 200 r/min)3 min，离心后注射器中的脂肪依次从上到下为三层，放掉最下层血水混合物，剩下上面两层，最上面一层为低密度脂肪和油滴，第二层为高密度脂肪，取出高密度脂肪放入新的注射器做容量填充用，将低密度脂肪和油滴层做脂肪干细胞胶用。将提取的低密度脂肪和油滴通纳米转换器A头和B头来回对推10次，放入离心机中离心(1 600 r/min)5 min，离心后，取出注射器，得到油脂和干细胞胶，注射器最上方为油脂层，最下方为干细胞胶，将最下方的干细胞胶取出置入新注射器备用，制做完毕。

脂肪颗粒制备：用20 ml注射器连接抽吸针头抽吸受试者大腿内侧脂肪组织，静置10 min，除去血性液体，装入10 ml离心管中离心(1 200 r/min)3 min，去除上层油和底层液体，得到的即为脂肪颗粒。

1.3大鼠分组及处理 将96只大鼠根据随机数字法分为SVF-GEL组和对照组，每组48只，SVF-GEL组大鼠移植0.3 ml脂肪颗粒和0.1 ml SVF-GEL；对照组大鼠移植0.3 ml脂肪颗粒和0.1 ml生理盐水。具体步骤为：SVF-GEL组将0.3 ml脂肪颗粒和0.1 ml SVF-GEL加入1 ml注射器中备用，对照组将0.3 ml脂肪颗粒和0.1 ml生理盐水加入1 ml注射器中备用；实验裸鼠用碘伏消毒，将上述装有移植混合物的注射器连接无菌注射针头注射进各组对应裸鼠背部左右肩胛处皮下相同位置，注射后针眼处涂抹金霉素软膏。

1.4移植脂肪组织中血管内皮生长因子(VEGF)水平测定 术后2 w，每组取12只大鼠，取大鼠移植脂肪组织，充分匀浆，采用ELISA测定移植脂肪组织VEGF水平。

1.5移植脂肪组织中血管数量测定 术后2 w，每组取12只裸鼠，取移植脂肪组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成5 μm厚切片。采用CD34免疫组化染色观察移植脂肪组织血管数量。将移植脂肪组织石蜡切片经烤片、脱蜡至水，加入过氧化氢孵育10 min去除内源性过氧化物酶活性，加入柠檬酸钠微波修复5 min，共2次，加入山羊血清孵育30 min封闭非特异染色位点，加入一抗：兔抗大鼠CD34抗体(1∶100)过夜孵育，加入山羊抗兔抗体二抗(1∶200)孵育1 h，加入苏木素孵育5 min染色细胞核，脱水，封片，拍照，计算每个高倍视野微血管数量。染色成黑褐色管状的为微血管。

1.6移植脂肪组织中脂肪细胞活力检测 采用Perilipin A免疫荧光法测定移植脂肪细胞存活率和小脂肪细胞数量：将石蜡切片脱蜡至水，加入双氧水孵育10 min去除内源性过氧化物酶活性，加入柠檬酸钠微波修复5 min，共2次，加入山羊血清孵育30 min封闭非特异染色位点，加入一抗：兔抗大鼠Perilipin A抗体(1∶200)过夜孵育，加入Cy3标记山羊抗兔抗体二抗(1∶100)孵育1 h，加入DAPI孵育30 min染色细胞核，封片，拍照，计算每个高倍视野存活脂肪细胞数量。Perilipin A阳性细胞为活的脂肪细胞，Perilipin A染色中小、高亮的脂肪细胞为活力更强的脂肪细胞。

1.7长期脂肪成活质量 术后12 w，每组取12只大鼠，取移植脂肪组织，多聚甲醛固定，进行常规HE染色，观察移植脂肪组织存活情况。评价方法：包括炎症细胞浸润、纤维化、囊泡3个评价参数，每个评价参数程度分为0～5共6个等级，无为0，少量为1，比中量少为2，中量为3，比中量多为4，大量为5，计算3个评价参数评分。

1.8移植脂肪组织长期体积存活率 术后12 w时，每组取12只大鼠，取移植脂肪组织，放入2.5 ml注射器(含有1 ml生理盐水)中，计算移植脂肪组织放入前后体积差值，即为移植脂肪组织的体积。脂肪组织体积存活率=12 w时脂肪体积/移植时脂肪体积×100%。

1.9统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组移植脂肪组织中VEGF水平和血管数量比较 术后2 w时，SVF-GEL组移植脂肪组织中VEGF水平和血管数量明显高于对照组(P<0.05)，见表1和图1。

表1 两组移植脂肪组织中VEGF水平比较

箭头标注为微血管图1 术后2 w两组脂肪组织中CD34 免疫组化染色(×400)

2.2两组移植脂肪组织中脂肪细胞存活率和小脂肪细胞数量比较 SVF-GEL组移植脂肪组织中脂肪细胞存活率和小脂肪细胞数量明显高于对照组(P<0.05)，见表2和图2。

2.3两组长期脂肪成活质量比较 术后12 w HE染色显示：SVF-GEL组炎症细胞较少，脂肪细胞大小比较均匀，囊泡少，纤维间隔少；对照组可见较多炎症细胞，脂肪细胞大小不等，囊泡和纤维间隔较多。SVF-GEL组大鼠炎症评分、纤维化评分和囊泡评分均明显低于对照组(P<0.05)，见表3和图3。

2.4两组移植脂肪组织长期体积存活率比较 SVF-GEL组大鼠移植脂肪组织长期体积存活率〔(54.16±7.18)%〕明显高于对照组〔(32.14±6.37)%,t=7.947,P=0.000〕。

表2 两组移植脂肪组织中脂肪细胞存活率和小脂肪细胞数量比较

Perilipin A阳性细胞为存活的脂肪细胞，箭头标注的为染色强阳性、圆形、体积小的小脂肪细胞图2 术后2 w两组脂肪组织Perilipin A免疫荧光染色(×400)

表3 两组大鼠炎症评分、纤维化评分和囊泡评分比较

图3 术后12 w两组脂肪组织HE染色(×400)

3 讨 论

自体脂肪移植已有百余年的历史了，最早移植的脂肪组织为块状脂肪，随着脂肪抽吸技术的发展，自体颗粒脂肪注射在脂肪移植中广泛应用〔5〕。因颗粒脂肪取材方便、来源广泛、可长期存在、无免疫排斥反应、外观和质感自然、手术损伤小等优点，使其在临床应用中优于生物填充材料，在软组织缺损或凹陷的填充中被广泛应用，尤其在隆乳手术和面部抗衰老中应用更为广泛〔6～8〕。颗粒脂肪在抗皮肤衰老方面可保护胶原蛋白、促进修复并分泌胶原蛋白、维护皮肤健康、促进皮肤细胞更新等，从而在皮肤年轻化方面发挥重要作用。但由于移植脂肪组织的吸收率比较高，因此一般需要多次手术才可得到满意效果，且移植后容易出现坏死、液化、硬结、囊肿、钙化等并发症，使其在脂肪移植中的应用前景受到限制〔9～11〕。因此减少脂肪移植后液化坏死、提高脂肪移植存活率具有重要意义。

移植脂肪的高吸收率和早期血管化不足关系密切。脂肪组织具有葡萄串样的空间结构，每个脂肪细胞有相应的单个血管供应，因此脂肪组织血液供应比较丰富，可保证其有充足的养分供应〔12〕。在颗粒脂肪的抽吸过程、收集过程及注射过程中，脂肪组织及其血管供应系统遭到破坏，仅留有少量血管片段〔13，14〕。研究发现脂肪移植早期主要靠组织间隙渗透作用维持营养供应，但这种渗透范围比较小，只有在这小范围内移植的脂肪组织可以存活，从而使脂肪移植早期脂肪组织的存活受到限制〔15〕。因此促进脂肪移植早期的血管化进程可为早期脂肪细胞提供养分和氧供，提高脂肪移植存活率。

SVF-GEL为采用简单的物理方法将抽吸脂肪组织去油而得到，是脂肪干细胞和脂肪组织中细胞外基质的原生态生理结合物，10 ml脂肪组织科提取1 ml SVF-GEL，其外观为呈类似透明质酸的凝胶状〔16〕。SVF-GEL富含血管内皮细胞、脂肪来源干细胞及其他细胞等。将SVF-GEL用于裸鼠创面，可促进裸鼠创面修复〔17〕。SVF-GEL在抗衰老方面可增加皮肤胶原蛋白，修复因衰老而导致的胶原蛋白断裂，增加皮肤光泽度使皮肤红润，改善颈纹、额纹、鱼尾纹、口周纹等局部细纹，淡化日晒斑、黄褐斑、雀斑等色斑，紧致皮肤、保持皮肤健康状态、减缓皮肤衰老等。移植脂肪可因组织缺血引起脂肪细胞死亡，脂肪细胞死亡后发出级联信号刺激脂肪干细胞，导致脂肪干细胞释放成血管因子，并分化为血管内皮细胞和新的脂肪细胞，表明脂肪干细胞可分化为新的脂肪细胞代替死亡脂肪细胞，还可促进血管生成，改善血液供应，从而提高移植脂肪的存活率。SVF-GEL因富含血管内皮细胞和脂肪干细胞及细胞外基质，这些成分均有利于血管化和成脂化。

本研究结果表明SVF-GEL可通过促进移植脂肪组织血管生成，提高移植脂肪组织活性和长期体积存活率。