张露，符珍，林莹，尹秀华

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

桄榔，在植物分类学上桄榔属于被子植物单子叶植物纲棕榈目棕榈科桄榔属桄榔种植物，是一种常绿乔木[1]。桄榔粉是广西著名的四大名粉之一，其营养丰富，含有较多的蛋白质，碳水化合物和多种微量元素，并且膳食纤维含量也较高[2]。食用桄榔粉对人体具有非常好的医疗保健作用，是一种纯天然的绿色保健食品[3]。

桄榔粉淀粉含量较高，占总桄榔粉的88.32%[4]，并且桄榔淀粉属于一种高直链淀粉。淀粉质食品在储藏过程中发生的凝胶强度、黏稠度、透明度、硬度、口感、黏弹性等功能特性的变化与淀粉老化的动态有着紧密的关系，老化会对淀粉质食品的质构特征产生明显的影响。淀粉老化是淀粉溶液或淀粉糊在较低温度条件下放置一段时间后，其溶液或糊液浊度增加并有沉淀析出的现象[5]。其实质是糊化后的淀粉分子从无序状态向有序状态转变的过程[6]。由直链淀粉形成有序结晶的过程称为短期老化，一般发生在糊化后的较短时间内；由支链淀粉外侧短链的重结晶所引起的老化称为长期老化，是一个相对迟缓的长期过程[7]。老化常常描述的是淀粉无序大分子的重组，是淀粉颗粒天然结构的重新组合，包含淀粉颗粒天然序列重组后形成的直链淀粉和直链淀粉分散体[8]。

桄榔淀粉的糊化特性、溶解性、持水性、膨胀度、热力学特性、流变特性、晶体结构和相对分子量分布已有研究报道[9-17]，而桄榔淀粉的老化特性研究还没有报道。因此，本试验以桄榔提取出来的桄榔淀粉为材料，采用示差扫描量热仪、X-射线衍射仪、低场核磁共振仪、质构仪、流变仪和扫描电镜对桄榔淀粉的老化特性进行了研究，探讨形成老化桄榔淀粉的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桄榔粉：广西龙州农业推广中心；纤维素酶（50 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；碳酸钠、盐酸（分析纯）：广西南宁沁田生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

循环水真空泵（SHZ-Ⅲ型）：上海亚荣生化仪器厂；射线衍射仪（MiniFlex600X）：湖南弘林科学仪器有限公司；扫描电镜（Phenom）：复纳科学仪器（上海）有限公司；流变仪（HAAKE MARS40）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；质构仪（TA-XT plus）：英国StableMicvo 公司；示差热量分析仪（DSC200PC）：德国耐驰仪器公司；低场核磁共振仪（MR1510100045）：上海纽迈电子科技有限公司；超低温冰箱（Forma 900 Series）：美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桄榔淀粉的制备

称量桄榔粉于烧杯中，加入30 倍水浸泡24 h，过120 目筛，用 0.5%的 Na2CO3按照 1∶3（质量体积比）浸提18 h，过滤，重复4 次。滤渣为米黄色粉末，用1 mol/L 盐酸调 pH 值为 5，按照 1∶6（质量体积比）加入纤维素酶，在50 ℃水浴锅中酶解1 h 后，用1 mol/L盐酸中和，再经水洗、静置、过滤、干燥、过筛（120 目），得到桄榔淀粉[17-18]。经测定桄榔淀粉中直链淀粉含量[19]为（60.07±2.92）%，水分含量为（10.98±0.06）%，粗脂肪含量为（0.19±0.04）%，粗蛋白含量为（1.85±0.35）%，粗纤维含量为（0.90±0.14）%。

测定方法为，粗蛋白含量的测定：GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；粗脂肪含量的测定：GB 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；粗纤维含量的测定：GB/T 5009.10-2003《植物类食品中粗纤维的测定》；水分含量的测定：GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》。

1.3.2 老化桄榔淀粉的制备

将桄榔淀粉样品与蒸馏水按1∶4（质量体积比）配制成淀粉溶液，于23 ℃下在磁力搅拌器上搅拌2 h，使两者充分混合。将混合液沸水浴糊化30 min，并不停搅拌直至完全糊化。然后分装在大小相同的培养皿中，并储存在 4 ℃下进行老化。分别在 0、1、3、5、7 d 测定质构和核磁，之后将老化样品放于-80 ℃超低温冰箱中冻藏，然后真空冷冻干燥，冻干样品粉碎后过120 目筛[20]，用于电镜和 X-射线（X-ray diffractometer，XRD）衍射分析。

1.3.3 颗粒形貌观察

将导电胶贴在扫描电子显微镜（scanning electronic microscopy，SEM）的样品台上，然后用专用镊子夹取少量真空冷冻干燥的样品，慢慢的在双面胶上涂抹均匀，吹扫多余的淀粉样品，采用离子溅射法在样品表面喷金。然后将样品台用镊子取出，放入扫描电子显微镜中进行仔细观察，拍摄具有代表性的淀粉颗粒形貌[21]。

1.3.4 示差扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）测定

将粉末状的老化不同天数的桄榔淀粉和蒸馏水按 1∶4（质量比）置于 DSC 坩埚中，密封，放在 25 ℃平衡2 h。然后放入示差扫描量热仪中以10 ℃/min 扫描速率从20 ℃升温到150 ℃，以空坩埚作空白对比，以氮气作为载气，流速为50 mL/min，测定老化样品的DSC 曲线。结果由 Proteus Analysis4.8 或者 origin9.1 软件进行分析、记录和计算起始老化温度（onset temperature，T0）、峰值老化温度（peak temperature，Tp）、终止温度（conclusion temperature，Tc）及老化热焓值（retrogradation enthalpy，ΔH）[22]。每个样品测试 3 次，取平均值。

1.3.5 X 射线衍射

采用X 射线衍射仪测定老化桄榔淀粉样品的结晶度，样品脱水干燥放置干燥器中1 周。衍射条件为：电压 40 kV，电流 15 mA，扫描范围为 2°～50°（2θ），扫描速率为2°/min。通过软件MDI jade6 分析X 射线衍射图谱并且计算老化桄榔淀粉的相对结晶度[23]。

1.3.6 质构测定

在特定的时间点取出凝胶状的老化样品，然后切割成大小相同的方块测其质构。选用质地剖析（texture profile analysis，TPA）模式（P2.5 探头）进行压缩试验，测定前下降的速度为1.0 mm/s，测定速度为5.0 mm/s，测定后上升的速度为5.0 mm/s，触发力为5 g，形变量比为75%。测定硬度的特征值，试验数据通过质构分析软件读取[24]。

1.3.7 低场核磁共振

将不同时间点的凝胶状老化样品取出切割、称量，利用核磁共振波谱分析软件中的自由感应衰减（free induction decay，FID）脉冲序列寻找中心频率及硬脉冲脉宽，将样品慢慢放入永磁体磁场中心射频线圈位置并进行信号采集，利用硬脉冲回波序列（carrpurcell-meiboom-gill sequence，CPMG）测定老化样品的T2 弛豫时间，将重复5 次采集生成的自旋回波对应的时段信号值与峰值计算平均值，并将平均值导入反演软件进行反演运算得到反演图谱[25]。

CPMG 脉冲序列的参数设置为：主频SF1=12 MHz，偏移频率 O1=215.827 kHz，90°脉冲射频脉宽 P1=8μs，180°脉冲射频脉宽 P2=11 μs，信号采样点数 TD=12 632，重复采样等待时间TW=5 000 ms，重复采样次数NS=2，回波个数 NECH=7 000。

1.3.8 流变测定

将样品与蒸馏水按照1∶4（质量体积比）配制成乳液，置于磁力搅拌器上搅拌5 min，然后沸水糊化10 min[26]。在 1 000 μm 的间隙平板（60 mm）进行流变学测量。将硅油添加到样品的暴露表面以防止在测定过程中的水分蒸发。在测量之前，将样品保持3 min 以平衡应力和温度。然后在老化期间以6.28 rad/s 的恒定频率和3%的恒定应力监测储能模量（G′）和损耗模量（G″）值[27]。

1.3.9 数据处理

试验数据用SPSS 22.0 统计分析软件和Microsoft Excel 2016 数据处理系统进行统计处理。计算标准偏差和显著性差异分析，利用Origin9.1 制图软件对数据作图，各试验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 微观形貌分析

天然桄榔淀粉（图1A）和桄榔淀粉凝胶老化（图1B～图1F）的扫描电镜图见图1。

图1 桄榔淀粉和老化桄榔淀粉扫描电镜图Fig.1 SEM of Arenga pinnata starch and retrograded starch

由图1 可看出，桄榔淀粉的颗粒形状大部分呈现椭圆形结构，整个表面平整，无凹陷和棱角，颗粒完整。而糊化后的桄榔淀粉失去了原桄榔淀粉的椭圆形颗粒结构，冻干后出现了许多孔洞，形成了不规则的网状形状（图1B），这是因为在糊化过程中，淀粉颗粒膨胀破裂直链淀粉和支链淀粉分子均充分展开并相互缠绕形成三维网状结构；并且从图1B、图1C、图1D、图1E、图1F 可以看出，随着桄榔淀粉凝胶的老化，其网状结构的壁厚呈现逐渐变厚的趋势，网状也在逐渐变小。这是因为在老化过程中，淀粉分子链发生重结晶，导致桄榔淀粉凝胶脱水缩合；同时，可能残余的淀粉颗粒存在，在扫描电子显微镜图中就呈现为不规则颗粒结构的形成[28-29]。

2.2 DSC分析

桄榔淀粉凝胶在老化过程中，淀粉分子从无序转化为有序，重排形成重结晶，因此要破坏这些新的晶体结构，使淀粉分子再次熔融需要外加能量[30]。老化后的淀粉凝胶在DSC 分析中出现吸热峰，其大小随老化程度的增加而增大。老化焓值越大说明重结晶越多，即老化程度越严重[20]。因此，老化焓值可作为衡量桄榔淀粉凝胶老化程度的指标。桄榔淀粉凝胶在4 ℃温度条件下分别储藏 0、1、3、5、7 d 后，用示差热量分析仪对其进行测定，并分析其在贮藏期间的热力学性质的变化，结果见表1。

表1 桄榔淀粉凝胶不同老化时间的DSC 参数Table 1 DSC parameters of retrograded Arenga pinnata starch gel

从表1 可以看出，随着储藏时间的延长，桄榔淀粉凝胶的起始温度和终止温度逐渐增加，同时其老化焓值也逐渐增加，说明桄榔淀粉凝胶的老化程度逐渐增大。从老化的第3 天开始，桄榔淀粉凝胶的热焓值增加缓慢。因为淀粉老化可以分为两个阶段：短期老化和长期老化[31]。桄榔淀粉中的直链淀粉含量约为60.07%，因此，储藏初始阶段桄榔淀粉老化焓值增大可能原因是桄榔淀粉中的直链淀粉含量相对较高。

2.3 XRD分析

淀粉是一种天然多晶聚合物，任何淀粉颗粒物态组成都可以看成是由亚微晶、微晶和非晶态三者中的1 种、2 种或3 种结构组合而成[32]。结晶束间区域分子排列无规律性，较杂乱为无定形区。支链淀粉分子很大，穿过多个结晶区和无定形区，在淀粉颗粒结构中起到骨架作用[33]。因为淀粉颗粒包括结晶结构和非晶结构。在淀粉受热溶胀、机械剪切、化学改性等物理、化学或生物处理过程中，淀粉颗粒的结晶结构会发生轻微变化，使原淀粉的结晶度下降，甚至变为零即结晶结构全部转为无定型结构[34]。

天然桄榔淀粉在 2θ 为 5.85°、15.07°、17.27°、23.30°、26.49°有明显的吸收峰，结晶结构为C 型[17]。桄榔淀粉在过量水分充分糊化处理后，衍射峰特别微弱并且晶体结构几乎完全消失，这是由于桄榔淀粉糊化后淀粉分子流动性增大，难以形成较大或较多的晶体结构。糊化后的桄榔淀粉在4 ℃条件下存放，会产生自组织的现象重新形成结晶[35]。老化桄榔淀粉X 射线衍射曲线见图2。

由图2 可知，桄榔淀粉糊化后在4 ℃分别存放0、1、3、5、7 d 后只有在 17°左右出现微弱的结晶峰。这种结晶度只有微小回升，说明结晶促进了桄榔老化淀粉的形成但并不是主要原因[35]。

图2 老化桄榔淀粉X 射线衍射曲线Fig.2 Retrograded Arenga pinnata starch X-ray diffraction curve

2.4 质构分析

老化不同天数的桄榔淀粉凝胶TPA 硬度结果见表2。

表2 老化不同天数的桄榔淀粉凝胶TPA 硬度Table 2 TPA hardness values of retrograded Arenga pinnata starch gel

淀粉凝胶的性质与淀粉的颗粒形状可能有关系，淀粉凝胶根据糊化温度和时间的不同形成的凝胶结构可能也不同[24]。所以桄榔淀粉分子经完全糊化后，桄榔直链淀粉和支链淀粉分子在冷却过程中均充分展开并且相互缠绕形成凝胶的三维网状结构。硬度是指样品第一次加压时所出现的最大峰值高度[36]。由表2可以看出，随着储藏时间的增加，桄榔淀粉老化的程度增加，凝胶硬度也随之增大。

2.5 核磁共振分析

老化不同时间的桄榔淀粉凝胶的横向弛豫时间反演图见图3。

脉冲核磁共振利用液体和固体在脉冲下信号的不同可以测定体系中固形物含量。淀粉体系的老化使淀粉分子逐步排列有序，处于结晶态的质子由于被其他分子链约束，因而只能在小尺寸范围内振动和迁移，因此体系中固形物的含量在逐步增加[37]。从图3 可以看出，水分流动性随着桄榔淀粉老化时间的延长变得缓慢，其持水性降低，结合水的能力变得较强，回生之后，结晶凝聚暴露在外面的有效羟基比较少，就其内部而言，老化桄榔淀粉中的水分流动性很低[38]。

图3 老化不同时间的桄榔淀粉凝胶的横向弛豫时间T2 反演图Fig.3 The transverse relaxation time T2 inversion spectrum of retrograded Arenga pinnata starch for different days

2.6 流变分析

桄榔淀粉凝胶贮能模量和损耗模量随时间变化趋势见图4。

图4 桄榔淀粉凝胶贮能模量和损耗模量随时间变化曲线Fig.4 Curve of storage modulus and loss modulus of retrograded Arenga pinnata starch

糊凝胶体系的动态黏弹性与其实际应用性能有直接联系。贮能模量（G′）代表能量贮存并且可恢复的弹性性质。当物料受到力作用时，其应力能量在变形中暂时储存，之后可以恢复；G′越大，物料受到力时的变形程度就越小，表明物料的弹性越大[39]。损耗模量（G″）代表能量消散的黏性性质。它表示阻碍物料流动的特性，是物料初始流动所需的不可逆损耗能量，已转变为剪切热；G″越大，表明受到力的作用时，物料越不容易流动，表明物料的黏性越大[26]。

由图4 可见，老化桄榔淀粉的G′远远大于G″，因此tanδ 小于1，G′与G″随时间增加而呈现缓慢上升的趋势，表明为一种典型的弱凝胶动态流变学谱图。Tanδ是G″与G′的比值，tanδ 越大，表明体系的黏性比例越大，流动性越强，反之则弹性比例较大。表明样品具有溶胶（有液态的流动性和黏性）和凝胶（固体状态下呈现有弹性）之间的力学物性，且弹性性质占主导地位，随着时间的延长，桄榔老化淀粉的弹性逐渐增加。直链淀粉部分链段和支链淀粉的分支点构成淀粉粒的无定形区，这说明淀粉粒有弹性形变的现象[40]。

3 结论

桄榔淀粉糊化后，淀粉颗粒结构被破坏，桄榔淀粉凝胶在老化过程中水分流动性降低，凝胶硬度增加，分子重排形成微弱结晶。桄榔淀粉凝胶在老化过程形成的晶体不同于原淀粉晶体，与桄榔原淀粉的相变吸热峰相比，老化淀粉的起始温度升高，吸热焓增大，表明较原淀粉老化后的桄榔淀粉形成了更致密的结晶结构，产生的晶体结构热稳定性增大。但是XRD结果表明桄榔淀粉凝胶仅形成微弱重结晶，说明了结晶不是桄榔淀粉老化的主要原因。低场核磁共振说明水分流动性随着淀粉老化时间的延长变得缓慢，其持水性降低，老化淀粉中的水分流动性很低。桄榔淀粉分子经完全糊化后，直链淀粉和支链淀粉分子在冷却过程中均充分展开并相互缠绕形成凝胶的三维网状结构，随着存放时间的延长，桄榔淀粉老化的程度增加，凝胶硬度也随之增大。桄榔淀粉的老化主要是因为桄榔淀粉分子的凝聚所致，微弱重结晶促进了淀粉的老化。