苏春艳，阮艳，彭诚

(1天津市职业病防治院，天津300000；2天津医科大学第二医院)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是临床常见的恶性肿瘤，其发病率居全球肿瘤的第六位。虽然近年OSCC的治疗取得了一定进展，但是OSCC患者5年生存率仍为40%左右[1]，其病死率无降低趋势。因此，开发治疗OSCC的新药至关重要。微小RNA(miRNA)属于非编码RNA，广泛表达于各种组织，其在恶性肿瘤组织中的异常表达有重要意义[2，3]，可作为药物靶点进行抗肿瘤治疗[4，5]。研究证实，在多种肿瘤组织中miR-195为抑癌基因[6，7]，其在OSCC组织中通过靶向RAF1基因抑制肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭及诱导细胞凋亡[8]。miRNA具有多个靶基因，并通过不同的靶基因调控不同的下游通路，发挥生物学功能[9]。而肿瘤恶性行为最重要的特征为恶性增殖，即细胞生长不受控制。2017年6月～2018年12月，本研究探讨miR-195过表达对OSCC细胞增殖的影响及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人OSCC细胞系SCC-4、SACC-83、Cal-27购自美国ATCC细胞库；DMEM培养基和FBS购自美国gibco公司；miR-195 mimic、成纤维细胞生长因子7(FGF7)过表达质粒、突变型(mut)与野生型(wt)FGF7的3′-非翻译区(3′-UTR)荧光素酶报告载体(FGF7-wt、FGF7-mut)购自中国上海吉凯基因化学技术有限公司；采用细胞活力测定(MTS)试剂购自美国Promega公司；逆转录、qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-195、FGF7、内参U6和GAPDH引物购自上海捷瑞生物工程有限公司；RIPA购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；pPI3K抗体(ab40755)、pAKT抗体(ab81283)和GAPDH抗体(ab9485)购自英国Abcam公司。RNA浓度测定仪Nanodrop2000和酶标仪购自美国Thermo公司；7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养及转染 细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，细胞融合度为95%左右传代。qRT-PCR技术检测细胞内miR-195表达，与正常人口腔黏膜成纤维细胞系HOMF细胞比较，SCC-4、SACC-83、Cal-27细胞中miR-195相对表达量低，且SCC-4细胞中最低。因此以SCC-4细胞作为实验细胞。SCC-4细胞长至融合度为80%左右将其铺至6孔板中，培养24 h。将细胞随机分为对照组、miR-195 mimic组、vector+miR-195 mimic组、FGF7+miR-195mimic组。将对照试剂、miR-195 mimic试剂分别与脂质体2000混合后按说明书转染至对照组、miR-195 mimic组，将FGF7过表达对照vector+miR-195 mimic试剂、FGF7过表达+miR-195 mimic试剂分别转染至miR-195 mimic+vector组、miR-195 mimic+FGF7组，放至培养箱中继续培养。

1.3 SCC-4细胞增殖检测 采用MTS实验。将转染24 h后的各组细胞经胰酶消化后，以每孔2 000个细胞、150 μL培养基接种于96孔板中，每组设置6个复孔，放置细胞培养箱中培养，分别于细胞贴壁后的第1、2、3、4天加入MTS工作液30 μL，37 ℃培养箱中避光孵育2 h，采用酶标仪检测样品在490 nm波长处的吸光度(OD)值，绘制细胞增殖曲线。

1.4 miR-195的靶基因检测 采用荧光素酶报告基因实验。用Target Scan7.2生物学信息软件预测miR-195与FGF7的3′-UTR区存在结合位点。将培养好的SCC-4细胞随机分为4组：FGF7-wt与miR-195 mimic共转染组(转染FGF7-wt+miR-195)、FGF7-wt与对照共转染组(转染FGF7-wt+vector)、FGF7-mut与miR-195 mimic共转染组(转染FGF7-mut+miR-195)、FGF7-mut与对照共转染组(转染FGF7-mut+vector)，分别完成转染48 h后收集细胞，根据双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.5 SCC-4细胞内miR-195、FGF7 mRNA表达检测 采用qRT-PCR实验。采用TRIzol法裂解细胞提取总RNA，并按逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA，每个样品设置3个复孔，PCR反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s，40个循环，进行荧光定量PCR。分析各样品的循环阈值(Ct)，miR-195相对表达以U6为内参基因，FGF7相对表达以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。miR-195上游引物序列：5′-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，下游引物序列：5′-TGCTGTGCCAGCTGCAGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。FGF7上游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，下游引物序列：5′-CAGGGCTGGAACAGTTCACAT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′。

1.6 SCC-4细胞内磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(pPI3K)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)蛋白表达检测 采用Western blotting实验。SCC-4细胞转染48 h，加入适量的含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA，充分混匀后冰上裂解20 min，14 000 r/min、4 ℃离心30 min，测定蛋白浓度，煮沸变性，行SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，8%脱脂牛奶封闭1 h，置于一抗稀释液中4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，二抗稀释液室温孵育1 h，ECL化学发光法显示蛋白条带。Image J软件分析蛋白电泳条带灰度值。实验重复3次,取平均值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白电泳条带灰度值/内参蛋白电泳条带灰度值

2 结果

2.1 miR-195过表达对SCC-4细胞增殖能力的影响 细胞贴壁后第1天miR-195 mimic组细胞增殖能力对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，第3、4天miR-195 mimic组细胞增殖能力较对照组低(P均<0.05)。见表1。

表1 miR-195过表达对SCC-4细胞增殖能力的影响

2.2 miR-195的靶基因 FGF7-wt+对照共转染组、FGF7-Wt+miR-195 mimic共转染组、FGF7-mut+对照、FGF7-mut+miR-195 mimic组荧光素酶活性分别为1.00±0.02、0.28±0.04、1.00±0.05、0.92±0.11。与FGF7-wt+对照共转染组比较，FGF7-Wt+miR-195 mimic共转染组荧光素酶活性低(P<0.05)；而FGF7-mut+对照组与FGF7-mut+miR-195 mimic组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组、miR-195 mimic组FGF7 mRNA相对表达量分别为1.00±0.05、0.25±0.13，miR-195 mimic组FGF7 mRNA相对表达量较对照组低(P<0.05)。证实FGF7为miR-195的靶基因。

2.3 FGF7对miR-195介导的抑制SCC-4细胞增殖作用的影响 细胞贴壁后第1天miR-195 mimic+FGF7组细胞增殖能力与miR-195 mimic+vector组比较差异无统计学意义(P>0.05)，第2、3、4天miR-195 mimic+FGF7组细胞增殖能力较miR-195 mimic+vector组高(P均<0.05)。见表2。

表2 FGF7对miR-195介导的抑制SCC-4细胞增殖作用的影响

2.4 miR-195过表达对SCC-4细胞内pI3K、pAKT蛋白表达的影响 对照组、miR-195 mimic组、miR-195 mimic+FGF7组pI3K蛋白相对表达量分别为1.00±0.05、0.28±0.04、0.33±0.08，pAKT蛋白相对表达量分别为1.00±0.05、0.14±0.05、0.31±0.10。miR-195 mimic组pI3K、pAKT蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.05)，miR-195 mimic+FGF7组pI3K、pAKT蛋白相对表达量高于miR-195 mimic组(P均<0.05)。

3 讨论

靶向治疗已经应用于肺癌、乳腺癌和胶质瘤等一些恶性肿瘤的治疗[11]，而尚未有疗效明确的靶向药物用于治疗OSCC。OSCC发病机制复杂多变，目前尚未完全阐明，但是癌基因激活、抑癌基因失活和表观遗传学修饰的改变已经明确与OSCC的发病密切相关[12]，因此从分子水平研究OSCC的发病机制，寻找靶基因为OSCC靶向药物开发提供新的方向。

miR-195属于miR-15/107家族成员[6，7]，miR-195可增强结直肠癌对放射和化学药物的敏感性，被一致认为是肿瘤增殖的抑制剂，在抗肿瘤方面具有较好的前景[13]。miR-195可抑制OSCC细胞增殖、侵袭和转移[8,14]。本研究发现miR-195过表达对SCC-4细胞增殖有抑制作用。

miRNA通过与靶基因3′-UTR结合抑制靶基因翻译或RNA降解来调控靶基因的表达，miRNA的靶基因可以为数个至几十个，通过靶向不同的靶基因发挥不同的调控作用[9]。郭芳等[8]报道，miR-195通过直接靶向抑制RAF1基因调控OSCC细胞的增殖及迁移、侵袭。Wang等[14]发现，miR-195靶向TRIM14基因抑制OSCC细胞的增殖、侵袭和转移。FGF7是FGFs家族的重要成员，在多种肿瘤组织中高表达，发挥癌基因的生物学表型[15，16]。本研究用Target Scan7.2生物学信息软件预测FGF7是miR-195调控的直接靶基因，在SSC-4细胞中miR-195抑制FGF7 mRNA的表达。进一步构建FGF7过表达质粒，与miR-195 mimic共转染SSC-4细胞，结果显示FGF7可以逆转miR-195的抑制作用，证实了miR-195通过负调控FGF7发挥抑制SSC-4细胞增殖的作用。

本研究发现miR-195靶向FGF7抑制SSC-4细胞增殖的作用，其具体的机制仍需进一步研究。肿瘤增殖失控导致恶性增殖是肿瘤发生的重要机制，在该过程中多种信号通路被激活，包括Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等经典信号通路[17]。其中在肾透明细胞癌组织中miR-195靶向VEGFR2抑制PI3K/Akt和Raf/ME/ERK信号通路诱导细胞凋亡[18]；在乳腺癌组织中FGF7与FGFR2结合激活PI3K/AKT信号通路[19]。本研究结果发现，miR-195 mimic与FGF7过表达质粒共转染组细胞中pPI3K、pAKT蛋白的表达升高。表明miR-195抑制SSC-4增殖的作用机制可能通过靶向负调控FGF7的表达抑制PI3K/AKT信号通路激活。

综上所述，miR-195在OSCC细胞中低表达，其低表达可抑制OSCC细胞增殖能力，可能的作用机制为靶向下调FGF7基因表达进而抑制PI3K/AKT信号通路的活性。本研究为miR-195作为治疗OSCC的潜在药物靶点提供了实验依据。