陈学瑜，罗芳秀，赵广垠，朱良纲

(上海交通大学医学院附属瑞金医院北院，上海201801)

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，近年其发病率与病死率有逐渐增高趋势。我国肺癌发病率5.88/万人，预后差，5年生存率仅为20.99%[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常见的病理类型，目前其尚缺乏有效的早期筛查手段，发现时患者多为晚期，并已存在远处转移[2],常规放化疗效果不佳。研究表明，NSCLC组织中表皮生长因子受体(EGFR)外显子19缺失及外显子21 L858R置换突变时，予以分子靶向药物如EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗，能有效缩小病灶，延长患者生存时间，提高患者生活质量[3]。但由于晚期NSCLC患者缺乏手术切除的肿瘤组织标本，并且纤维支气管镜、经皮肺穿刺活检等手段获取的肿瘤组织有限，难以根据EGFR基因突变情况选择是否予以TKI治疗[4]。近年来随着新的诊断技术的发展，可检测患者外周血来源于肿瘤的游离DNA(ctDNA)中EGFR基因突变，其敏感性、特异性及稳定性较高[5]。本研究检测NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突变，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年2月～2018年2月本院诊治的晚期NSCLC患者77例，男46例，女31例；年龄37～81(58.2±7.3)岁；肺腺癌59例，肺鳞状细胞癌(鳞癌)18例；有吸烟史29例；汉族72例；肿瘤分期[6]均为Ⅳ期；美国东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态评分：0～1分55例，≥2分22例。纳入标准：均经病理检查确诊为NSCLC；年龄≥18岁；治疗前未接受其他抗肿瘤治疗；具有至少1个可评价的肿瘤病灶。排除标准：临床资料不完整；伴其他恶性肿瘤、急性传染病；收集的血液样本量不足或被污染；伴明显的心、肝、肾等脏器功能损害。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 治疗方法与疗效评价 患者均予以TKI治疗，TKI药物种类根据临床经验进行选择，吉非替尼250 mg口服，1次/d；厄洛替尼150 mg口服，1次/d。治疗期间密切监测患者血尿常规、肝肾功能，并做心电图检查，直至出现严重的患者不能耐受的不良反应，或出现肿瘤进展、远处转移停止治疗。采用实体瘤评价标准进行近期疗效评价[7]，完全缓解(CR)：全部病灶已消失；部分缓解(PR)：肿瘤灶最大径缩小>30%；稳定(SD)：肿瘤灶最大径变化20%～30%；疾病进展(PD)：肿瘤灶最大径增大>30%或出现新病灶。客观缓解率(ORR)=(CR例数+PR例数)/总例数×100%，疾病控制率(DCR)=(CR例数+PR例数+SD例数)/总例数×100%。无进展生存时间(PFS)为自开始口服药物治疗到出现疾病进展或死亡的时间。用药后1个月评价疗效，之后每3个月复查1次，随访方式为门诊或电话随访，随访截止至2018年3月。

1.3 外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变检测 TKI治疗前用突变扩增阻滞系统法(ARMS)检测患者外周血ctDNA中EGFR基因突变情况。患者禁食8 h后采集清晨空腹静脉血10 mL，置于EDTA抗凝管中室温下2 000 g离心10 min分离上清液，8 000 g离心10 min分离血浆，取上清液置于离心管中保存于-80 ℃冰箱中待测。应用血浆游离DNA分离试剂盒(艾德生物公司)提取患者血浆游离DNA，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。应用NanoDrop 2000核酸定量测定仪对DNA的浓度进行定量测定，吸光度(OD)260与OD280比值为1.8～2.0。应用ARMS在荧光定量PCR仪上对外周血ctDNA中EGFR基因突变进行检测，实验步骤严格按照试剂盒(艾德生物公司)说明书进行操作。同时对肿瘤组织中EGFR基因突变进行检测，样本均为甲醛固定石蜡包埋的标本，每个样本切片8张，应用DNA提取试剂盒提取DNA(厦门艾德生物公司)，测定浓度后保存于-20 ℃冰箱中，ARMS检测步骤同上。突变结果根据试剂盒说明书进行判定，基因突变含量>1%，突变Ct值≥29判定为基因突变。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2或Fisher确切概率法。Kaplan-Meier生存分析(Log-rank检验)基因突变与患者生存预后的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变比较 外周血ctDNA中EGFR基因野生型46例，突变型31例，其中外显子19缺失突变型16例、外显子21 L858R错义突变型12例、外显子20 T790M突变型3例。肿瘤组织中EGFR基因突变33例(42.9%)，其中外显子19缺失突变型14例、外显子21 L858R错义突变型16例、外显子20 T790M突变型3例。外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变率比较差异无统计学意义(P=0.744)，二者EGFR基因突变位点分布比较差异无统计学意义(P=0.814)。

2.2 外周血ctDNA中EGFR基因突变与NSCLC患者临床病理参数的关系 腺癌患者的EGFR基因突变率高于鳞癌患者，不吸烟患者的EGFR基因突变率高于吸烟患者(P均<0.05)；外周血ctDNA中EGFR基因突变与患者年龄、性别、民族及ECOG评分无关(P均>0.05)，见表1。

表1 外周血ctDNA中EGFR基因突变与NSCLC患者临床病理参数的关系(例)

2.3 外周血ctDNA中EGFR基因突变与近期疗效及预后的关系 77例患者中，CR 0例、PR 31例、SD 29例、PD 17例。不良反应均为1、2级腹泻与皮疹，未发生3、4级不良反应，无患者因严重不良反应退组或减少用药剂量。外周血ctDNA中EGFR基因突变型患者CR 0例、PR 19例、SD 10例、PD 2例，ORR 19例(61.3%)，DCR 29例(93.5%)；野生型患者CR 0例、PR 12例、SD 19例、PD 15例，ORR 12例(26.1%)，DCR 31例(67.4%)。外周血ctDNA中EGFR基因突变型患者ORR、DCR均高于野生型患者(P均<0.05)。至随访结束，共51例患者出现疾病进展或死亡，外周血ctDNA中EGFR基因突变型和野生型患者中位PFS分别为9、4个月，突变型患者中位PFS长于野生型患者(P=0.022)。

3 讨论

NSCLC的传统治疗方法是以铂类为基础的多周期化疗，但毒性反应限制了化疗的临床应用。近年来随着针对不同生物靶点的靶向药物的出现，如TKI、针对血管内皮生长因子受体的单克隆抗体等，患者长期生存和预后有所改善。EGFR是一种含486个氨基酸受体蛋白，相对分子质量约170 kD，其结构分为胞外区、跨膜区及胞内区，是第1个被鉴定为与表皮生长因子结合的具有酪氨酸激酶活性的受体。EGFR的磷酸化对细胞增殖及细胞内信号转导有重要作用，参与了肺癌、胃癌、胰腺癌及肾癌等多种不同类型肿瘤的发病和进展[8]。因此，EGFR已被认为是癌症治疗的重要分子靶标，并且已经开发和研究了部分抗EGFR抑制剂，包括单克隆抗体或小分子TKI。目前美国食品药品管理局批准上市的TKI包括吉非替尼、厄洛替尼等，该类药物与细胞毒类药物相比，能延长EGFR阳性的NSCLC患者总体生存时间和PFS。NSCLC患者中EGFR基因突变状态在EGFR-TKI的治疗反应中起重要作用。但10%～15%的NSCLC患者无法获取足够的肿瘤组织进行分子检测。

ctDNA是细胞坏死或凋亡后释放入外周血的DNA，是来源于肿瘤细胞的游离DNA。外周血ctDNA水平可反映肿瘤组织中基因的突变状态，但外周血中ctDNA水平低，很难被检测到。随着诊断技术的发展，ARMS、液相色谱分析技术等可检测到低水平的ctDNA。研究表明，与健康人群相比，NSCLC患者外周血ctDNA水平明显升高，并且与原发肿瘤组织具有一致性[9]。本研究比较外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变情况，结果表明外周血ctDNA与肿瘤组织中EGFR基因突变具有较好的一致性。两种标本中EGFR基因突变率差异无统计学意义，且二者突变位点也较一致，结果与以往研究[10]一致。因此在无法获取肿瘤组织时，检测外周血ctDNA的EGFR基因突变可能是一种合理的替代方法。

本研究进一步研究外周血ctDNA中EGFR基因突变与患者临床病理参数的关系，结果表明，外周血ctDNA中EGFR基因突变与肿瘤病理类型、患者吸烟史有关，腺癌的EGFR基因突变率高于鳞癌，不吸烟患者高于吸烟患者，而与年龄、性别、民族及ECOG评分无关。周建娅等[11]研究表明，NSCLC患者EGFR基因突变多见于腺癌、女性及不吸烟的患者。目前已明确吸烟是肺癌的重要病因，但不吸烟患者的EGFR基因突变率明显升高，其机制尚不清楚，原因可能为吸烟与不吸烟患者肿瘤发生的分子机制不同，涉及的驱动基因和信号传导通路也不同[12]。癌症基因组图谱研究网络数据库中，肺腺癌患者的驱动基因主要为TP53、KRAS及EGFR基因，而在肺鳞癌患者中，KRAS及EGFR基因突变较为少见[13]。本研究未发现EGFR基因突变与性别有关，可能与样本少有关，需多中心、大样本进一步深入研究。

近年来，虽然新的细胞毒药物、免疫治疗药物等提高了抗癌的疗效，但在延长患者的总体生存时间、PFS及生活质量上，尚无满意的结果。本研究进一步研究外周血ctDNA中EGFR基因突变与患者近期疗效的关系，结果表明外周血ctDNA中EGFR基因突变患者的ORR、DCR均高于野生型患者。研究表明，与标准化疗相比，EGFR敏感突变的NSCLC患者应用吉非替尼、厄洛替尼TKI治疗的ORR较高[14]。EGFR基因的突变包括19外显子缺失、21外显子L858R突变及18外显子的G719X突变，上述突变可引起野生型结构中维持激酶非活性状态的疏水残基结构的破坏，引起EGFR持续活化，因此予以TKI治疗的有效率较高[15]。此外，本研究中ctDNA中EGFR基因突变型患者的中位PFS明显优于野生型患者，与以往报道[16]一致。因此，晚期NSCLC患者选择治疗方案之前，应对EFGR的突变状态进行检测，从而对靶向治疗效果进行预测，以便选择最优的治疗方案[17]。

综上所述，在缺乏肿瘤组织标本时，检测NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突变是一种可行的替代方式，有助于治疗方案的选择及预后判断。但本研究限于样本较少，有待进一步开展前瞻性、多中心、大样本的临床研究。