张祥，储海峰，胡白，陆闻生

[1 .皖南医学院，芜湖 241002；2.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)皮肤性病科]

史蒂文斯-约翰逊综合征(SJS)、中毒性表皮坏死综合征(TEN)，剥脱性皮炎型药疹(ED)及超敏反应综合征(HSS)等严重皮肤药物不良反应(cADRs)严重威胁人类的健康和生命[1]。严重皮肤药物不良反应又称重症药疹，其发病机制复杂，可能与变态反应、遗传等多种因素有关，其中最常见的诱发因素是服用抗癫痫药物。重症药疹患者可引起败血症和呼吸衰竭，有高达30%的死亡率[2]，通常被认为是不可预测的。虽然有研究表明[3-4]携带HLA-B*1502等位基因人群服用卡马西平诱发SJS和TEN危险性增加，几乎达到100%，而在轻度药物不良反应患者很少携带。然而,在一些研究中[5-6]，卡马西平诱发的部分SJS和TEN患者却并未携带HLA-B*1502等位基因，这表明除了HLA-B*1502等位基因，携带HLA-B其他等位基因也可能诱发重症药疹。目前还不清楚，携带HLA-B*1502等位基因人群服用其他抗癫痫药物如苯巴比妥及拉莫三嗪是否会出现重症药疹。本研究主要通过测定服用抗癫痫药物的重症药疹患者外周血相关HLA-B等位基因，探讨HLA-B等位基因与重症药疹的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 耐受组成员之间与病例组成员之间均无血缘关系。

病例组：选自安徽省立医院2014年5月至2018年6月入住皮肤科及相关科室病房，确诊的史蒂文斯约翰逊综合征、中毒性表皮坏死综合征，史蒂文斯约翰逊综合征-中毒性表皮坏死综合征重叠型患者，诊断参照第8版《皮肤性病学》[7]，共25例。患者除服用抗癫痫药12周内未服用其他药物，患者之间没有血缘关系，都在疾病的急性期，并有典型的皮损表现。男9例，女16例；年龄范围14～81岁，年龄(49.8±7.6)岁。所有患者对研究内容具有知情权并签署知情同意书。

耐受对照组：耐受对照来自安徽省立医院神经外科、神经内科服用卡马西平、苯巴比妥和拉莫三秦3个月内未引起药疹的住院患者，共50例。年龄、性别与病例组相匹配[男19例，女31例；年龄范围29～78岁，年龄(51.5±9.7)岁]。

1.2 研究方法 标本采集:从病例组和耐受对照组采集外周静脉血2～5 mL于EDTAK3抗凝管中，稍放置后置于离心机中离心(3000 r/min，3 min)，将血清提取至冻存管中，然后存放于-80 ℃冰箱，血细胞留置在管中存放于4 ℃冰箱备用。

DNA提取: DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司生产)。

引物设计与合成: 通过查阅文献，本研究选取了5个与免疫性疾病相关性较高的HLA-B等位基因，分别如下：HLA-B*15:02、-B*40:01、-B*58:01、-B*13:01和HLA-B*38:02，采用PCR-特异性引物(PCR-SSP)方法进行分型。HLA-B基因扩增的引物序列参考文献中的序列[8]。

结果判断以及质控: PCR反应设置阳性对照(测序确定是同一亚型的样本)与阴性对照(不加DNA模板)，且每一个反应孔均添加一对保守的内参引物。当阳性对照正常出现、阴性对照表现为阴性时，若仅出现内参照带则为阴性，内参照带及目的条带都出现则为阳性，只有目的条带出现也为阳性。

1.3 统计学处理 通过PLINK 1.07软件分析比较两组的等位基因频率，比较各组的P值、相对危险度用优势比(OR值)、95%置信区间(95%CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征 总共25例患者被收集(男性占36%)，重症药疹发病的年龄是(49.8±7.6)岁(范围14～81岁)，其中14例是由于服用卡马西平，11例服用其他抗癫痫药诱发(其中包括5例苯巴比妥和6例拉莫三嗪)。25例患者完成了基因分型，50例服用抗癫痫药物未出现药疹的人群被作为耐受对照组，他们的年龄是(51.5±9.7)岁(范围29～78岁)，男性占38%。

2.2 HLA-B等位基因分型结果 病例组与耐受对照组分型结果见表1,2。在病例组中最常见的等位基因频率为HLA-B*1502(64%)，HLA-B*13:01 (12%),和 HLA-B*38:02 (8%)。而在耐受对照组最常见的等位基因频率为HLA-B*40:01 (32%),HLA-B*58:01 (18%) 和HLA-B*15:02(14%)。总的来说，病例组携带HLA-B*1502等位基因要显著高于耐受对照组(P=9.6×10-6，OR=10.92，95%CI:3.07～41.00)。HLA-B*1502携带率，很大程度是由卡马西平引起，服用卡马西平诱发重症药疹的患者相比服用卡马西平耐受组携带HLA-B*1502携带率显著高(P=7.0×10-6，OR=36，95%CI:4.65～375.97),这种HLA-B*1502携带率增高趋势在苯巴比妥诱发重症药疹患者也存在(P=0.013，OR=45，95%CI=1.47～7827.55)，但在拉莫三嗪组没有相关性(P=0.879，OR=0.33，95%CI=0.01-8.01)。病例组携带HLA-B*40:01等位基因低于耐受对照组(P=0.045，OR=0.18， 95%CI：0.03～0.97)。

表1 两组HLA-B各等位基因的情况

表2 服用不同抗癫痫药物在病例组与耐受对照组中的HLA-B*15:02等位基因分布

3 讨论

关于重症药疹的病因及发病机制已有许多文献述及，目前免疫学说是研究热点[9]。人类白细胞抗原(HLA)，是由一系列紧密连锁的基因座位所组成的具有高度多态性的复合遗传系统，每一个基因座位都有很多共显性等位基因。HLA不但在免疫反应中起重要的作用，而且还具有单倍体遗传、高度多态性、连锁不平衡性等遗传特征。

本研究通过PCR-SSP的方法对HLA-B等位基因进行分型，采用病例对照研究分析了这些HLA-B等位基因与重症药疹发病的相关性。对于多等位基因比较采用bonferi校正P值的方法,以减少多重比较引起的误差导致的假阳性。为了反映关联的强度,同时计算了OR值及可信区间,OR值指某事物发生与不发生的概率之比,可以反映某因素与疾病的关联程度,如小于1,则该因素与疾病成负相关,如大于1,则该因素与疾病成正相关,值越大,说明关联的程度越强。

通过HLA-B基因分型，本组证实了前期相关研究结果，HLA-B*1502与抗癫痫药物诱发的重症药疹有相关性。本组发现这种相关性主要与卡马西平密切相关，这与中国台湾相关研究[10]结果相似。本组研究结果进一步支持HLA-B*1502应该作为一个药物基因生物标志，在服用卡马西平之前应该接受该等位基因检测，从而避免携带该等位基因人群服用卡马西平发生重症药疹。抗癫痫药物中出现交叉反应是很常见的现象。在相关的研究表明苯巴比妥和拉莫三嗪与重症药疹具有相关性，但结果并不一致，这可能与研究的患者数量小有关，需要Meta分析进一步证实[11-12]。最近对卡马西平及有类似结构的药物体外实验表明，卡马西平与HLA-B*1502之间的相互作用及对T细胞的刺激5-羧氨基起着至关重要的作用。虽然抗癫痫药物都具有芳香环结构，但拉莫三嗪和 苯巴比妥都不具有羧基，而丙戊酸钠和加巴喷丁不具有芳香环结构。这些抗癫痫药物之间结构的差异可以很好地解释HLA-B*1502与严重的药物不良反应发生在不同的抗癫痫药的差异。除了HLA-B*1502外，HLA-B*1508在印度人群[13]，HLA-B*1511、 HLA-B*1518在日本人群[14-15]，也有报道[16]HLA-B*1521与卡马西平引起的SJS和TEN有相关性。这种现象可能是与HLA-B*1502相似的氨基酸序列的同源性可能引发类似严重药物反应[17]。有几项研究也表明某些HLA等位基因对卡马西平诱发重症药疹具有保护作用，与卡马西平耐受对照组相比，在病例组携带频率较低，这其中包括HLA-B*40:01。一种HLA等位基因可能会增加由一种药物引起的严重药物反应，却会降低其他药物引起相同表型严重药物反应的风险[18]。最近全基因组关联研究表明等位基因变异、Th1/ Th2平衡关系，相关炎性反应在哮喘和自身免疫疾病存在相反的基因关联方向。对HLA等位基因与严重药物反应的分析可以进一步揭示某种药物与HLA等位基因分子结合改变了抗原形状和化学性质的变化，从而改变抗原性和诱发T细胞激活。可以想象相同的HLA分子与不同药物的相互作用，对下游的肽链会产生不同的影响。这一发现也表明，除了HLA等位基因外，其他因素可能与严重的药物不良反应的发病机制有关。T细胞受体(TCR)的大量克隆增殖表明了其对严重的药物不良反应发生机制起重要作用。值得进一步研究的是，同样或者不同的TCR克隆类型是否会由其他药物诱发重症药疹个体中发现。

总之，HLA-B*1502与卡马西平诱发的重症药疹有紧密的联系。可能的保护因素HLA-B*40:01与重症药疹相关性需要进一步调查。