李智伟，田永芳，卢佩佩，刘小双，岳晓媚，王昌敏△

(1.新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心，新疆乌鲁木齐 830001；2.新疆医科大学基础医学院，新疆乌鲁木齐 830011)

类风湿性关节炎(RA)是以关节肿痛，滑膜关节破坏为特征的一种自身免疫性疾病。该病女性多发，年龄分布广泛，致残率较高[1]。目前其发病原因尚不完全清楚，研究报道淋巴细胞在疾病的发病和进展中均发挥重要作用[2]。淋巴细胞包括T、B、NK细胞，T细胞又分为辅助性T细胞(CD4+)和细胞毒T细胞(CD8+)。CD4+T在一定条件下可分化成辅助性T细胞1(Th1)、Th2、Th17、调节性T细胞(Treg)等不同亚型，进而调控免疫应答。Th17细胞介导炎性反应，Treg细胞介导免疫抑制，两者的分化过程和功能相互拮抗。Th17/Treg失衡可导致机体的损害。本文通过分析RA患者和健康人群的T、B、NK细胞的分布及Treg和Th17细胞在RA患者中的平衡变化，探讨Th17/Treg平衡与RA疾病之间的关系，为临床免疫治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年6-12月新疆维吾尔自治区人民医院住院的RA患者65例为RA组，其中男18例，女47例；年龄37～74岁，平均(55.6±10.1)岁；汉族36例，其他民族29例。RA组纳入标准：符合美国风湿病学会与欧洲风湿病防治联合会2010年制定的RA诊断标准[3]。排除标准：排除患有肿瘤、其他自身免疫病和感染疾病的者。选择67例体检健康者作为健康对照组，其中男20例，女47例；平均(52.5±11.3)岁。经统计分析各组性别、年龄、民族差异均无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象均都被告知标本采集的目的并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)；试剂：Multitest IMK Kit(340503)；CD3-FITC(555339)；CD3-PerCP(552851);CD4-FITC(555346)；CD4-PE(555347)；IL-17A-PerCP(560666)；CD127-PE(561028)；CD25-APC(555434)；IgG1-PE(555749)、IgG1-APC(550854)、BD Cytometer Setup&Tracking Beads Kit(641319)以及溶血素(349202)、破膜剂(641776)、Trucount绝对计数管(340334)和Falcon流式进样管均购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 所有研究对象均于清晨空腹采集全血2 mL，使用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，标本于室温保存，当日完成上机检测。

1.3.2流式细胞仪检测T、B、NK淋巴细胞 使用两个Trucount的计数管，一管加入50 μL全血和20 μL Multitest IMK Kit A试剂(CD3/CD8/CD45/CD4)，第二管加入50 μL全血和20 μL Multitest IMK Kit B试剂(CD3/CD16+56/CD45/CD19)。震荡混匀避光放置15 min后加入450 μL溶血素，放置15 min后上机。每次检测前使用BD Cytometer Setup&Tracking Beads Kit进行质控，必要时调整机器电压和补偿。结果使用BD Canto软件进行自动检测分析。

1.3.3流式细胞仪检测Treg和Th17细胞 Treg细胞设置两管，一管试验管，加入CD4-FITC、CD3-PerCP、CD25-APC、CD127-PE，另一管对照管加入CD4-FITC、CD3-PerCP、IgG1-PE、IgG1-APC。孵育15 min后加入溶血素2 mL，10 min后离心洗涤上机；Th17细胞也设置两管，均先加入CD4-PE、CD3-FITC，孵育10 min后加入破膜剂A液再孵育5 min，加入溶血素10 min后离心弃上清后加入破膜剂B液，两管再分别加入IL-17A-PE和IgG1-PE，孵育15 min后洗涤离心弃上清后上机检测。全部试剂均加入试剂说明书推荐的剂量。每次检测前使用BD Cytometer Setup&Tracking Beads Kit进行质控，必要时调整机器电压和补偿。使用BD DIVA软件进行分析，以CD3和CD4设门，CD127low和CD25+细胞为Treg细胞；IL-17A+细胞为Th17细胞。

2 结 果

2.1T、B、NK细胞分析 从比例来看，与健康对照组相比，RA组的CD4比例明显增高，差异有统计意义(P<0.01)；CD8比例明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；CD4/CD8比值显著增高，差异有统计学意义(P<0.01)。B细胞和NK细胞构成无明显变化。见表1。

从绝对计数来看，RA组的T、B、NK细胞数量均比健康对照组低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 RA组与健康对照组淋巴细胞亚群构成结果比较

表2 RA患者组与健康对照组淋巴细胞亚群绝对计数结果比较(个

表3 RA组与健康对照组Treg和Th17结果比较

注：A图CD127lowCD25+为Treg细胞，B图CD4+IL-17+为Th17细胞

图1Treg和Th17流式细胞图

2.2Treg和Th17细胞分析 RA组患者的Treg细胞较健康对照组有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)；Th17细胞较健康对照组明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3和图1。

3 讨 论

RA是一种自身免疫性疾病，RA的发病机制与免疫系统密切相关[4]。各类淋巴细胞通过相互作用来维持机体正常的免疫平衡，T淋巴细胞介导细胞免疫，辅助性T细胞根据机体免疫状况可以进一步分化成各类Th亚型细胞，并分泌不同的细胞因子来调节免疫系统，细胞毒T细胞(Ts)能够特异型杀伤靶细胞[5-6]。在本研究中，RA组的CD4比例高于健康对照组，CD8比例低于健康对照组，CD4/CD8比值高于健康对照组，B细胞和NK细胞比例无明显变化，与之前的研究相似[7-8]。从绝对计数方面比较来看，T、B、NK细胞数量整体低于健康对照组。RA患者患病时，机体的免疫平衡已被打破，由于疾病的免疫应答改变造成CD8的下降较CD4更为显著，在RA发病后CD4被诱导分化成各亚型的能力也发生变化。Treg和Th17是近年来发现的在自身免疫性疾病中发挥重要作用的Th亚型[9-10]。Th17细胞通过分泌IL-17、IL-21和IL-23等细胞因子发挥免疫功能[11]，IL-17是强大的促炎症因子，IL-17增多可以放大免疫级联反应，进一步加重机体的炎性反应[12]。Treg细胞是负相免疫调节细胞，Treg可以释放IL-10、TGF-β等细胞因子发挥抑制作用，进而避免机体产生过度的免疫反应[13-14]。在本研究中发现RA患者Treg显著低于健康对照组，Th17显著高于健康对照组，说明在RA患者体内平衡向促炎方向倾斜。健康者的免疫系统与骨骼系统之间是依靠紧密的相互作用来维持机体平衡的，RA是平衡出现紊乱的结果，活化的T细胞导致破骨细胞激活并产生骨侵蚀。有报道证实，Th17细胞通过上调滑膜成纤维细胞上的RANKL以及诱导局部炎性反应的方式，破坏关节炎中的骨组织[15]。在RA发病时Treg数量和功能也均产生异常，治疗后Treg和Th17的平衡则会恢复到健康者的水平[16-17]，这些报道也证明了Treg和Th17的平衡的改变与RA疾病有一定的相关性。由于试验条件有限，本研究并未进一步对Treg和Th17的相关细胞因子进行检测。但是深入了解细胞亚群和细胞因子的网络调节对揭示RA的发病机制很有帮助[18-19]。目前已有报道尝试使用抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对RA进行治疗[20]，相信通过对淋巴细胞亚群及细胞因子进一步研究，能够找到很好的RA免疫治疗的靶点，为该病诊断和治疗提供帮助。

综上所述，本研究结果显示,RA患者会出现淋巴细胞亚群比例改变和Treg/Th17 比例失衡的免疫现象，说明淋巴细胞各个亚群均可能参与了RA发生和发展。 Treg/Th17平衡也与RA疾病相关，在抑制炎性反应过度和疾病进展加重中发挥重要的调节作用。未来可以进一步深入研究以寻找潜在的免疫治疗靶点。