彭书生，王 科，袁永强

(重庆医科大学附属永川医院检验科,重庆 402160)

人乳头瘤病毒(HPV)是一类感染表皮和黏膜鳞状上皮的小DNA病毒，具有高度种属特异度，人类皮肤角质形成细胞/黏膜鳞状上皮细胞是其天然宿主，目前最新研究认为HPV基因型有100多种，其中有40多种与人类生殖道感染相关。多中心、多样本研究表明超过70%的女性一生中至少感染一次HPV，其中大部分能自身清除，也有少部分持续感染高危型HPV的女性逐步发展成宫颈上皮内瘤变(CIN)，并进一步发展为宫颈癌[1]。多个国家相关的临床指南推荐将高危型HPV检测用于筛查宫颈癌[2-3]。本研究对就诊于本院的患者进行23种HPV常见亚型检测，了解本地区HPV感染现状和亚型分布情况，为HPV疫苗的选用以及宫颈癌预防提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入标准：2015年9月至2017年5月来本院就诊并接受HPV基因分型检测的女性患者。排除标准：患者资料完整度低于80%；月经期间、严重的疾病或精神疾患无法配合的患者。经筛选后得到10 889例患者，分别来源于妇科、产科、计划生育科、健康管理科、泌尿科等15个科室门诊或住院部，年龄16～84岁，平均年龄43.76岁。

1.2试剂和仪器 普通PCR扩增仪(杭州博日生物技术有限公司)，恒温金属浴(上海嘉鹏科技有限公司)，H18全自动核酸杂交仪(深圳亚能生物技术有限公司)，高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，HPV23型基因芯片检测试剂(深圳亚能生物技术有限公司)。

1.3标本采集及保存 患者自愿接受检查并在采集标本前将相关事宜告知：月经正常的妇女，在月经来潮后第10～18天为最佳检查时间，检查前3天内不要做阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物；检查前24 h内不应有性行为。以专用宫颈脱落细胞采集器对宫颈外口鳞-柱上皮移行区进行采样。完成采样后，将拭子或采集器放入专用的样本保存管中，并贴上患者的条形码，标本一经采集，应尽快用冰壶或泡沫箱加冰袋密封送检，标本室温保存不超过12 h，4 ℃保存不超过7 d，-20 ℃保存不超过3个月，避免反复冻溶。

1.4方法

1.4.1样本DNA提取 充分震荡洗脱宫颈刷，将洗脱液0.5 mL转移到1.5 mL微量离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃去上清液，保留管底的细胞块。加入100 μL裂解液悬浮沉淀，100 ℃加热10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清待用。

1.4.2PCR扩增 取PCR反应管，在管壁上做好标记，低速离心机瞬时离心2 s，然后分别加入上一步保留的上清液(即待测样本DNA )5 μL ，PCR反应的总体积为25 μL。按以下条件进行扩增：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 15 min。PCR扩增完成后，95 ℃变性10 min，立即置冰上2 min。

1.4.3芯片杂交和显色 取出全自动核酸杂交仪孵育盒，依次放入标有编号的膜条(在膜条的一角用签字笔标记)，然后将上一步中变性后产物全部加入全自动核酸杂交仪孵育盒，进行PCR膜杂交、洗膜与显色。

1.4.4HPV结果判读 HPV杂交膜条IC位置出现蓝色，可认为此次结果有效，否则为病例取样不成功或试验操作不成功；经由芯片阅读仪扫描读取分析结果，将大于8.8灰度值(int)的检测结果判断为阳性。

1.5统计学处理 使用SPSS20.0统计软件，计数资料以率表示，采用χ2检验进行数据分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1HPV感染 本研究所纳入的10 889例患者标本中，检出HPV感染者2 679例，感染率为24.60%。HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83型共23种亚型均有检出。其中单一型、二重型、多重型(三重及以上)感染例数分别为1 926、508、245例，感染率分别为17.69%、4.67%、2.25%，见表1。

表1 HPV感染情况(%)

2.2HPV感染的亚型分布 单纯高危型别(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82)和单纯低危型别(HPV6、11、42、43、81、83)感染例数分别为1 538和388例，感染率分别为14.12%和3.56%，单纯高危型检出数是单纯低危型检出数的3.96倍。高危型(含单一、二重、多重)感染率前3位分别是HPV52、16、53，感染例数分别为588、503、296例，感染率分别为5.40%、4.62%、2.72%，在HPV感染的患者中所占比例分别为21.95%、18.78%、11.05%。低危型(含单一、二重、多重)感染率前3位分别是HPV81、43、42，感染例数分别为359、167、116例，感染率分别为3.30%、1.53%、1.07%，在感染患者中所占比例分别为13.40%、6.23%、4.33%。见表2。

在二重型感染中，高危型以HPV52和HPV68混合感染为主，其次为HPV16和HPV52(或HPV51和HPV52)混合感染、HPV52和HPV53(或HPV52和HPV58)混合感染，分别为16、14、13例。低危型以HPV43和HPV81混合感染为主，其次为HPV42和HPV43(或HPV42和HPV81)混合感染，分别为14、2例。高低危混合型以HPV52和HPV81为主，其次为HPV16和HPV81、HPV43和HPV52混合感染，分别为13、11、10例。

2.3不同年龄段感染HPV情况 根据就诊患者生理及社会生活特点，将所有患者分为<20岁、20～30岁、30～40岁、40～50岁、≥50岁共5个年龄组。各年龄段总感染例数分别为15、298、545、1 071、750例，分别占总感染患者的0.56%、11.12%、20.34%、39.98%、28.00%。整个研究对象以单一感染为主，高发年龄40～<50岁；二重感染次之，高发年龄50岁及以上；多重感染最少，高发年龄50岁及以上；二重及多重感染中年龄越大，感染率越高。整个年龄组以40～<50岁感染率最高，其次50岁及以上年龄段，整体呈倒“U”型。见表3、图1。HPV感染率在不同年龄组间差异具有统计学意义(χ2=13.26，P<0.05)。

表2 HPV感染的亚型分布(n)

注：二重型及多重型感染例数不能由此表纵向直接相加得到，因为这样二重型及多重型包含的HPV亚型会存在重复计算，其具体例数需排除重复部分

表3 不同年龄段感染HPV情况

图1 不同年龄段感染HPV情况

3 讨 论

全球性的调查研究显示，宫颈癌在女性恶性肿瘤中占据第二位[4]。研究表明HPV感染与宫颈疾患有着密切联系，WHO于1995年将HPV感染确定为宫颈癌的病因，高危型HPV持续性感染是导致上皮内瘤变发生的重要条件，若不及时处理，可进一步发展为宫颈癌[5]。可见，HPV感染能对广大女性的健康造成严重影响，甚至威胁生命。因此，临床对高危人群筛查HPV感染能及时发现高危感染并进行适时适当的干预，预防上皮内瘤变甚至宫颈癌的发生、发展。同时，研究不同地区HPV感染现状有助于评估各地区HPV流行情况，制订针对性的防治措施，还能为国产HPV疫苗的研制方向提供指导。

本研究发现重庆市永川地区进行HPV检测的10 889人中，检出HPV感染者2 679例，感染率24.60%，与我国大部分同类研究结果基本一致，但HPV感染型别上存在一定差异[6-7]。在永川地区感染HPV亚型中，高危型HPV感染前3位分别是HPV52、16、53，低危型HPV感染前3位分别是HPV81、43、42。与本地区先前的研究[8]相比，各型别所占比例发生改变，HPV52亚型取代HPV16亚型成为高危型中感染率最高的型别，与国内外部分研究报道的HPV16亚型感染率最高有一定的差异[9-10]，与云南省的一项大样本分析一致[11]。其原因可能是HPV亚型分布存在明显的地区差异，我国人口众多，人文地理环境复杂，人口流动、当地经济、教育条件、某区域生活方式或风俗的不同等均可使各地区HPV亚型分布不尽相同[12]，但有研究显示地理位置靠近的区域HPV感染的流行情况接近[13]，结合我国各地优势HPV亚型基本一致的特征，本文将其特点归纳为总体呈现“大体符合，区域差异”。同时本研究也提示某地区HPV的流行情况可能会随着时间推移发生变化，这表明即使是同一地区，也应定期进行HPV的流行病学调查，以便及时调整该地区的防控策略。本地区二重感染的感染率较高，而多项研究结果表明混合感染特别是高危型混合感染可大幅增加宫颈病变和发展为宫颈癌的风险[14]。因此，针对这部分患者的早期诊断和及时干预显得尤为重要 。此外本研究结果还显示目前HPV感染率以 40～<50岁最高，整体呈倒“U”形,与国内外部分研究结果显示HPV检出率呈双峰年龄分布存在差异[15-16]。这可能与纳入的样本量或地区差异有关，也可能与本地区人群对HPV筛查重视程度有关。

自2006年美国批准使用HPV疫苗以来，一项来自澳大利亚的研究显示女性接种人群HPV感染率下降了77%，效果显著[17]。2016年7月我国也正式批准HPV疫苗在我国的应用，但目前使用的疫苗由于从国外引进，二价疫苗(HPV16、18亚型)、四价疫苗(HPV6、11、16、18亚型)均没有针对HPV52、58亚型是我国HPV感染常见亚型的特点，尽管疫苗对未包含的亚型存在交叉保护作用，但仍难以达到较全面有效的HPV预防[18]。本地区高危型HPV52、16、53、58亚型的感染率较高，预防接种时选取九价HPV疫苗能更好地进行覆盖。根据本地区随着年龄增加HPV感染率增高的特点及HPV疫苗在感染前接种效果更好的特性，推荐本地区有接种条件的女性尽早进行疫苗接种。但由于我国人口基数大及九价疫苗价格昂贵，覆盖范围受限，因此，推动针对我国国情或区域特点的国产HPV疫苗研制，可能将更合理、高效地防控HPV感染，使宫颈癌有望成为人类第一个通过综合防控战胜的恶性肿瘤[19]。

4 结 论

重庆市永川地区HPV的感染率、感染亚型及年龄分布较本地区以往研究有所变化：感染率前5的亚型分别为HPV52、16、81、53、58型，HPV52超过HPV16成为感染率最高的HPV亚型；感染率最高的年龄段也由30～<40岁变为40～<50岁，感染率曲线整体呈倒“U”形。根据本地区特点，推荐有接种条件的女性尽早进行HPV亚型覆盖面更广的疫苗的接种，并加强本地区HPV宣传及筛查工作，实现HPV的有效防控并为区域性HPV疫苗的研制提供指导。