徐 智，张友志，郭昌洪，易生福

1.湖北省荆州市中医医院药剂科(荆州 434010)；2.湖北省荆州市中医医院制剂中心(荆州 434010)； 3.湖北中医药高等专科学校实验中心(荆州 434020)

益气化瘀口服液系由黄芪、赤芍、当归、丹参、山楂、牛膝、葛根、红花等十六味中药组成的复方制剂，是我院已故著名老中医刘云鹏主任医师(1910-2013)自用养生秘方，其80岁时贡献于医院，经现代制药技术加工制作而成，具有益气活血化瘀之功效。治疗高脂血症45例，总有效率91.1%；治疗高黏稠血症108例，总有效率100%；明显降低血清中同型半胱氨酸(HCY)水平，从而降低缺血性脑卒中发生风险[1-3]。取得医疗机构制剂注册批准文号(鄂药制字Z20180696)，院内临床使用多年，患者反响良好。益气化瘀口服液现行质量标准是对当归和丹参进行薄层鉴别，为了更好制定本制剂的质量控制标准，提高药品安全性、稳定性，让患者放心服用本药品，本研究在原薄层鉴别的基础上增加了黄芪的薄层鉴别，并采用高效液相色谱--蒸发光散射检测器(HPLC--ELSD) 法对方中君药的主要化学成分-黄芪甲苷进行含量测定。以期为益气化瘀口服液的质量控制标准提供依据。

材料和方法

1 仪器与试药

1.1 仪器：Waters1525高效液相色谱仪；Alltech ELSD-2000 蒸发光散射检测器；METKER AE240电子分析天平；N2000色谱工作站；SP-30E型全自动薄层色谱点样仪；GoodLook-1000型-全自动薄层色谱成像系统；ICH 110型恒温箱；KH5200V型超声波清洗器；D24UV型超纯水器。

1.2 试药：黄芪甲苷标准品(批号：0781-201711)、黄芪对照药材(批号：140991-201707)、当归对照药材(批号：151311-201801)、丹参对照药材(批号：131312-201704)，均来自中国食品药品检定研究院(NIFDC)，甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂都为分析纯。益气化瘀口服液由荆州市中医医院制剂中心提供，(批号：20180425、20180814、20181019，规格10ml/支)。

2 薄层鉴别

2.1 当归：取益气化瘀口服液30 ml，正丁醇提取3次，每次50 ml，加入正丁醇后用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次30 ml，用正丁醇洗至中性。向正丁醇蒸干后的残渣中加入甲醇1 ml溶解，作为供试品。取除当归外的其他成分，按照供试品溶液制备工艺和前期处理方法，制备阴性对照组溶液。将1 g当归对照药材加入30 ml甲醇，加热回流1 h，冷却后过滤、蒸干，残渣中加水30 ml使之溶解。同法制备对照品溶液。按照《中华人民共和国药典(2015年版)》的薄层色谱法，吸取上述溶液各5 μl，点于硅胶G薄层板(10×20 cm)上，用氯仿-甲醇-水混合液(13∶6∶2)的下层溶液作为展开剂[4-5]，取出、晾干。喷10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰为止。见图1。

1：当归阴性对照品；2：当归对照品；3：当归供试样品；4：当归对照药材

图1当归TLC图谱

2.2 丹参：取益气化瘀口服液15 ml，用三氯甲烷提取2次，每次15 ml，合并提取液，蒸干后加1 ml甲醇于残渣中，作为供试品溶液。取除丹参以外的其他成分，按照供试品溶液制备工艺和前期处理方法，制备阴性对照组溶液。取将1 g丹参对照药材加入30 ml水，加热回流1 h，冷却后过滤、蒸干，残渣中加2 ml乙醇使之溶解。同法制备对照品溶液。按照《中华人民共和国药典(2015年版)》的薄层色谱法，吸取上述溶液各5μL，点于硅胶G薄层板(10×20cm)上，用环乙烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙肝混合液(3∶3.5∶1.5∶0.5∶1)的下层溶液作为展开剂[4-6]，置于展开缸，预饱和30 min，展开，取出并晾干，365 mm紫外灯下检视。见图2。

1：丹参阴性对照品；2：丹参对照品；3：丹参供试样品；4：丹参对照药材

图2丹参TLC图谱

2.3 黄芪：取益气化瘀口服液30 ml，加入稀盐酸调整pH值至2。采用醋酸乙酯震荡提取3次，每次50 ml，随后水浴蒸干，向残渣中加入甲醇1 ml使之溶解，作为供品溶液。取除黄芪以外的其它成分，按照供试品溶液制备工艺和前期处理方法，制备阴性对照组溶液。将1 g黄芪对照药材加入乙酸乙酯-甲醇混合液(3∶1)60 ml中[4,7]，加热回流30 min，过滤，蒸干，向残渣中加入甲醇5 ml使之溶解，将上清液作为对照药材溶液。取黄芪苷为对照品，参照《中华人民共和国药典(2015年版)》[8]的薄层色谱法，吸取上述溶液各1 μL，点于硅胶G薄层板(10×20 cm)上，用醋酸丁酯-甲酸-水混合液(7∶4∶3)的上清液为展开剂，展开后取出，晾干。喷2%三氯化铁乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰为止。见图3。

1：黄芪阴性对照品；2：黄芪对照品；3：黄芪供试样品；4：黄芪对照药材

图3黄芪TLC图谱

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；Thermo色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)以乙晴-水(30∶70)溶液为流动相，流速为1 ml/min[9-10]。柱温设置为30℃，检测时波长设置为276 nm。蒸发光检测器温度设置为70℃，气流2 L/min、增益2。理论塔板数按照黄芪甲苷峰计算≥4000。色谱图如图4。

图4 黄芪甲苷的HPLC色谱图

3.2 对照品溶液的制备：取黄芪甲苷标准品6.25 mg，将其置于25 ml容量瓶中，加入甲醇定容，浓度为250 μg/ml，将其作为母液。取母液1.25 ml、2.5 ml、3.75 ml、5 ml、6.25 ml、7.5 ml分别置于25 ml容量瓶，用甲醇溶解作为对照品。

3.3 供试品溶液的制备：取益气化瘀口服液，摇匀，过滤，精密量取20 ml，置100 ml 分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，20 ml/次 , 弃去三氯甲烷[8], 水层再用水饱和的正丁醇萃取4次(30、30、20、20 ml), 最后1次水放净,合并4次正丁醇萃取液, 用氨试液洗涤2次(每次5 ml );弃去氨试液,继续用正丁醇饱和水溶液洗至中性,弃去水液。取正丁醇溶液蒸干,残渣加水10 ml ,使其溶解通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.0 cm ,长15 cm),依次用水50 ml、40 %乙醇50 ml、70 %乙醇50 ml洗脱 ,收集70 %乙醇洗脱液,蒸干,精密加入甲醇(色谱纯)10 ml使其溶解, 定容,作为供试品溶液[11-13]。

3.4 阴性对照品溶液的制备：按照益气化瘀口服液原方组成及制备方法，按“3.3”项下方法制备不含黄芪的阴性样品溶液。

结 果

1 线性关系考察 精密吸取黄芪甲苷(C=0.25 mg/ml)对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，注入色谱仪中，测定峰面积。回归方程：Y=1.74X-156.61，r=0.9996(n=6)表明黄芪甲苷在0.120～0.745 μg范围具有良好的线性关系。

2 稳定性试验 精密吸取由益气化瘀口服液制成的供试品溶液10 μl，分别于1、2、4、8、12、24 h测定黄芪甲苷含量，结果RSD%为0.52%，说明24 h内其稳定性良好。

3 精密度试验 标准品(0.25 mg/m)10μl，重复进样6次，测定其峰面积，计算RSD%为1.48%。

4 重复性试验 取同一批号样品(批号：20180814)分成6份样品溶液，按“3.1”色谱条件测定其峰面积。结果RSD%为2.66%。

5 回收率试验 精密量取样品6份，每份(0.25 mg/ml)1 ml，置于25 ml容量瓶，加入益气化瘀口服液4 ml，按照益气化瘀口服液供试品制备，上样10μL，按“3.1”项下方法测定，计算回收率，平均值为96%，RSD%为1.45%(n=6)。见表1。

表1 加样回收率试验结果

6 含量测定 取不同批次益气化瘀口服液按上述方法测定黄芪甲苷的含量，3批样品测量，见表2。

表2 三批黄芪甲苷含量检测结果

讨 论

益气化瘀口服液方中重用味甘性温的黄芪，入脾肺二经，可大补元气，益卫升阳，祛瘀而不伤正，是为君药，现代药理研究表明其具有抗衰老、增强代谢、降压、保护心功能、免疫调节等作用。医院以前的审定鉴别标准中，只对方中当归、丹参进行薄层鉴别，本研究在此基础上增加了黄芪的薄层色谱鉴别，多项薄层鉴别保证定性鉴别结果更准确，在薄层的基础上，本研究紧跟现代制药技术，参考相关文献对方中16味中药的理化性质进行理论分析，确定了对方中黄芪的主要化学成分黄芪甲苷进行了含量测定。依据《中国药典》2015版要求，对中药制剂需进行定量分析，从院内自制制剂长远发展的角度，须提升院内制剂的质量标准。黄芪为益气化瘀口服液方中的君药，经现代药理研究证明，其主要核心成分是黄芪甲苷。目前对黄芪甲苷含量测定的方法有薄层色谱扫描法、UV-HPLC法和ELSD-HPLC法。但黄芪甲苷仅在200nm紫外区有末端吸收，故用UV-HPLC 法干扰很大。而蒸发光散射检测器为通用型检测器，适用于无紫外末端吸收皂苷类化合物，它具有分辨率高, 重复性好 , 简便快速的优点。