姜 帅

辽宁省锦州市中心医院心内科(锦州 121000)

黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是由黄芪的根经提取得到。黄芪多糖提取物中含有多种组分,包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖，是一种具有多种药理作用的天然药材。近年来，黄芪多糖的抗炎、抗氧化、调控免疫力、抗肿瘤等能力备受研究者的关注[1-2]。这对于中药活性研究及中药现代化也起到一定的推动作用。炎症是血管中活性物质对病灶部位所进行的抵抗反应。血管内膜完整性是维持内环境稳定的重要因素，炎症、高血压、心血管疾病等会引起内皮损伤从而诱发其他疾病的发生[3]。炎症小体是多种蛋白质组成的复合体，在机体免疫反应与疾病发生过程中具有重要的作用[4]。炎症小体的激活可以直接导致白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(Interleukin -18,IL-18)等炎症因子的释放[5]。目前发现的炎症小体有3种，即核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)、黑色素瘤-2(Absent in melanoma-2，AIM2)[6]。NLRP3是近年来研究较多的一种模式识别受体，它是由NLRP3、半胱氨酸蛋白酶Caspase-1、凋亡相关斑点样蛋白构成[7]。胞内各种危险信号都可激活NLRP3，导致Caspase-1剪切成分子量更小的Caspase-1 P10片段，从而使得下游的IL-1β和IL-18等炎症因子产生[8-9]，最后导致心血管疾病的病变和发展。还有研究表明脂质尤其是饱和脂肪酸沉积可引起 NLRP3 炎性小体相关基因表达升高，促进局部炎症反应[10]。

黄芪多糖具有抗炎、抗氧化、降脂和免疫调节等生物学活性，且不易残留、副作用小、毒性低。在细胞层面、分子层面上具有一定的抑制炎症反应的能力。有研究证明黄芪多糖可以降低糖尿病大鼠游离脂肪酸的水平，其可能的机制是黄芪多糖通过非胰岛素通路活化腺苷酸激活蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)]通路[11-12]。还有研究者认为黄芪多糖降低细胞 TLR4/ NF-KB mRNA 表达，下游炎症因子含量降低，在一定程度可缓解细胞损伤，其机制可能是通过抑制TLR4/ NF-KB通路，调节炎症反应而发挥抗炎作用[13-14]。但是很少有人研究黄芪多糖是否通过抑制NLRP3炎症小体通路进行炎症的抑制反应，包括抑制Caspase-1活性片段的生成，以及减少IL-1β等炎症因子的产生，从而抑制HUVECs炎症反应的产生，因此本研究探讨黄芪多糖抑制炎症的相关机制，验证NLRP3炎症小体是否参与该抑炎过程。

材料和方法

1 材 料

1.1 实验试剂：ECM培养基以及胰蛋白酶购自Gibico。胎牛血清和PBS缓冲液(0.01M)购自以色列BI公司。 Caspase-1抑制剂YVAD、甘氨酸、Tris-base、SDS、脱脂奶粉、牛血清白蛋白BSA、长链游离脂肪酸(油酸∶软脂酸=2∶1)购自美国Sigma公司。NLRP3 siRNA转染试剂盒购自美国罗氏公司。BCA 蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo。RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、ECL发光染色剂购自北京索莱宝生物科技有限公司。蛋白酶抑制剂、三酰甘油测试试剂盒和游离脂肪酸试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。SDS上样缓冲液、丙烯酰胺、硝酸纤维素膜购自安布雷拉公司。NOX4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗购自美国 Abcam，荧光二抗抗体抗体购自CST。

2 研究方法

2.1 细胞培养：人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)购于美国ATCC中心。用含1%内皮细胞生长补充剂、5%胎牛血清、1%双抗的ECM培养基培养细胞，于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养，融合度达90%以上后，胰酶消化细胞，胎牛血清终止消化，以1∶2或1∶3比例进行传代。

2.2 实验分组及其干预：时间梯度刺激实验即分组包括阴性对照组、游离脂肪酸组、4组时间梯度APS组(3、6、12、24 h)。5%胎牛血清的ECM培养基培养HUVEC细胞。除阴性对照组，其他各组加入长链游离脂肪酸 0.25 mmol/L预处理。然后改用不含血清的ECM进行培养，饥饿24 h。其他时间组在不同时间点加入200 mg/L、APS 200 μl，充分混匀，筛选出适合的时间用于NLRP3干扰和Caspase-1阻断实验。

2.3 浓度梯度刺激实验：分组包括阴性对照组、游离脂肪酸组、4组浓度梯度APS组(50 mg/L组、100 mg/L组、200 mg/L组、400 mg/L组)。除阴性对照组外，其他各组加入长链游离脂肪酸 0.25 mmol/L预处理。细胞饥饿24 h后，其他各组分别加入不同浓度黄芪多糖 200 μl，充分混匀，刺激12 h，筛选出适合的浓度用于NLRP3干扰实验和Caspase-1阻断实验。

2.4 抑制NLRP3基因表达实验：分组包括阴性siRNA组(Scramble)、阴性siRNA 加 APS组、抑制NLRP3 siRNA组、抑制NLRP3 siRNA 加APS组，共四组。各组先用游离的脂肪酸预处理12 h，无血清ECM培养基培养细胞饥饿24 h。各组分别加入相应的RNA转染，其中Scramble siRNA + APS组、NLRP3 siRNA+APS组加入200 mg/L 黄芪多糖 200 μl，共孵育12 h。

2.5 抑制Caspase-1表达实验：分组包括阴性对照组、APS组、Caspase-1抑制剂YVAD组、APS + YVAD组，共四组。各组先用游离脂肪酸预处理。细胞饥饿24 h后，在YVAD组、APS+YVAD组加入20 μl YVAD(4×10-5mol/L)预处理1 h。然后在APS组、APS + YVAD组，加入200 mg/L APS 200 μl，充分混匀，刺激12 h。

3 三酰甘油含量测定 采用三酰甘油试剂盒检测三酰甘油含量[15]。APS 200 mg/L刺激内皮细胞12 h，PBS冲洗3次，加入提取液(缓血酸胺20 mmol/L，硫酸镁4 mmol/L，氯化钠80 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L，乙二胺四乙酸5 mmol/L， 二硫苏糖醇2 mmol/L，pH值7.4)1 ml， 加入氯仿-甲醇2 ml(体积比2∶1)，匀浆2 min，室温搅拌混匀30 min，室温下3000 rpm 离心10 min(离心半径13.5 cm)，用氯仿-甲醇2 ml再次抽提后，取2次抽提的氯仿-甲醇于35℃真空抽干,50 μl异丙醇复溶，用三酰甘油试剂盒进行检测。

4 游离脂肪酸含量测定 游离脂肪酸检测试剂盒检测游离脂肪酸。APS 200 mg/L刺激内皮细胞12 h，PBS洗涤3次，然后超声破碎细胞，每次 5～10 s，进行20次，1300 rpm离心10 min，上清液备用。 采用乙酰辅酶A合成酶-乙酰辅酶A氧化酶法测定。在上清液10 μl中加入400 μl发色试剂A；5 min后，加入200 μl发色剂B；10 min后，测定546 nm和660 nm吸光度。 游离脂肪酸浓度测定由全自动生化仪完成。

5 免疫印迹试验(Western blot)检测 蛋白表达 NLRP3、NOX4、Caspase-1 以及 IL-1β蛋白的表达水平通过免疫印迹试验检测。具体步骤如下：在刺激时间结束后，弃去旧培养基，用PBS清洗3次，加入适量的含有蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，用细胞刮迅速刮起细胞碎片，离心后上清就是裂解得到的蛋白质，BCA试剂盒检测蛋白质浓度。稀释成合适的上样浓度，加入上样缓冲液，100℃煮沸5 min使得蛋白变性[16]。SDS-PAGE电泳法分离不同相对分子质量的蛋白质。将电泳分离后的蛋白在4℃条件下电转移至硝酸纤维素膜。加入7%的脱脂奶粉或2% BSA蛋白溶液的封闭液孵育条带膜，置于摇床上室温孵育，封闭1 h。TBST摇床洗3次，每次5 min。加入用TBST稀释比例为1∶5000的NOX4、NLRP3、Caspase-1 和 IL-1β一抗，于摇床上室温孵育1 h。TBST摇床洗3次，每次5 min。加入用TBST稀释比例为1∶10000的荧光二抗，于摇床上避光孵育1 h。TBST摇床避光洗3次，每次5 min。用滤纸在膜周围吸水后，加入少量的ECL染色剂染色，放入荧光扫描仪暗室内扫描，得到蛋白条带图片。用Image-J软件对图片进行灰度分析，以β-actin为参比蛋白。

6 ELISA法测试上清细胞因子 利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试阴性对照组、游离脂肪酸、游离脂肪酸与APS组与HUVEC细胞共孵育12 h后细胞上清的炎症细胞因子TNF-α、IL-8和IL-18。

7 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件对所有数据进行统计学分析。计量数据都以均数±标准差表示，各组间的对比采用单因素方差分析及t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 适合的刺激浓度与时间筛选 表1结果显示随着时间的延长，APS对游离脂肪酸的清除成正比，但是在12～24 h清除效果基本不变，所以筛选出黄芪多糖适合的刺激时间在12 h。

表2结果显示随着APS浓度的增高，游离脂肪酸清除效果也呈浓度依赖性增高，而在200～400 mg/L的清除效果达到平台期，所以筛选出APS适合的浓度在200 mg/L。综上在200 mg/L浓度下刺激12 h达到最好的清除游离脂肪酸的效果，与游离脂肪酸对照组有统计学的差异(P<0.05)，用于后续的NLRP3干扰实验和Caspase-1阻断实验。

表1 各组不同时间梯度刺激后游离脂肪酸的浓度(μmol/L)

表2 各组不同浓度梯度刺激后游离脂肪酸的浓度(μmol/L)

2 三酰甘油及游离脂肪酸含量测定 与对照组比较，APS组三酰甘油及游离脂肪酸含量差异均无统计学意义(均P>0.05)，游离脂肪酸组中三酰甘油及游离脂肪酸含量均明显升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。与游离脂肪酸组比较，游离脂肪酸加APS组三酰甘油及游离脂肪酸含量均明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

3 各组蛋白及细胞因子表达情况 游离脂肪酸组与阴性对照组对比，NOX4、NLRP3、Caspase-1 和IL-1β都明显升高，与游离脂肪酸组比较，APS组各种蛋白表达均有不同程度的降低。随着时间的增加，蛋白表达在降低，但在12～24 h的降低不是很明显，见图1。且这四种蛋白中，NLRP3变化最为显著。随着黄芪多糖浓度的升高，各个蛋白表达在降低，变化率最大的也是NLRP3蛋白,且在黄芪多糖200 mg/L、400 mg/L浓度下，各个蛋白与游离脂肪组相比均有明显的降低，有统计学差异(P<0.01)，见图2。

表3 各组APS刺激12 h后三酰甘油与游离脂肪酸浓度

NLRP3基因干扰实验及Caspase-1阻断实验情况见图3、图4。进一步观察APS对这两种基因的影响。游离脂肪酸在处理后，NLRP3沉默基因会使NLRP3蛋白表达量显著降低(P<0.01)，而单独APS的作用与沉默基因的效果相似(P<0.01)。且相对于APS以及NLRP3沉默基因单独作用，两者共同作用下，NLRP蛋白表达降低更多。Caspase-1阻断实验也是相似的结果。在Caspase-1抑制剂YVAD作用下，Caspase-1显著降低(P<0.01)。单独APS作用下Caspase-1也显著降低(P<0.01)。且相对于各自单独作用，在YVAD与APS共同作用下，Caspase-1蛋白表达降低更多。由此可见APS可通过抑制NLRP3、Caspase-1表达，阻断下游炎症通路，抑制IL-1β炎症因子产生，抑制细胞凋亡。同时还用ELISA方法测试了炎症因子TNF-α、IL-8及IL-18，APS相对于游离脂肪酸组显著降低了这些炎症因子的表达。

图1 不同时间梯度刺激后Western blot测试各个蛋白表达情况(A)及其定量(B)

图2 不同浓度梯度刺激后Western blot测试各个蛋白表达情况(A)及其定量(B)

图3 NLRP3沉默基因刺激后Western blot测试各个蛋白表达情况(A)及其定量(B)

图4 Caspase-1抑制剂YVAD刺激后Western blot测试蛋白表达情况(A)及其定量(B)

讨 论

免疫炎症是引发心血管疾病的重要因素，它能使心血管疾病从早期无症状阶段发展到损伤状态以及具有明显功能障碍的高级阶段，其主要表现为内皮细胞功能障碍、动脉粥样硬化、血管壁病变等[17]。因此，深入研究血管内皮炎症的机制具有重要意义，可为心血管疾病的预防、治疗及预后提供有力的依据。具体来说，血管内皮炎症反应包括促炎因子和粘附因子的表达，以及后续的脂质过氧化及细胞迁移等不良表现。有研究者通过大鼠的烫伤模型，检测不同时间段的血清中炎症因子表达水平的改变，发现APS对IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 多种炎症因子的表达具有抑制作用，表明APS可以抑制烫伤引起的炎症反应[18]。人体主要的炎症细胞有淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，TNF-α与IL-8是主要的炎性因子，TNF-α是主要由单核巨噬细胞在细菌、病毒感染时释放的生物活性物质，会促进中性粒细胞脱颗粒、蛋白水解酶释放，介导炎症反应[19]。IL-8也由单核巨噬细胞产生，主要活性是招募和激活中性粒细胞，诱导大量氧自由基、花生四烯酸等炎症介质释放而加重炎症[20]。因此我们同时检测了炎症因子TNF-α与IL-8的表达情况，结果表明APS组相对于游离脂肪酸组显著降低了这两种炎性因子的表达，佐证了APS的抗炎作用。

当血管内皮细胞启动炎症反应，包括氧化应激状态下引起炎症，都可能导致血管内皮功能被破坏。炎症小体是一种多蛋白复合体，在机体免疫反应与疾病发生过程中具有关键的作用，NLRP3炎症小体的机制被研究得最多、最全面[21]。NLRP3会感受细胞内的危险信号，尤其是细胞内受到刺激后大量生成的活性氧。活性氧可以激活NLRP3炎症小体从而诱导IL-1β、IL-18等炎症因子的表达[22]。NLRP3炎症小体具体是如何参与到血管内皮炎症的过程还没有研究透彻。本研究发现200 mg/L黄芪多糖与游离脂肪酸共培养12 h后，HUVECs的NLRP3相对应的 NLRP3 和 Caspase-1 表达都有明显下调，伴随着NOX4蛋白表达降低，同时也减少了NLRP3底物IL-1β剪切的具有炎症活性的IL-1β P17片段，说明抑制了NLRP3炎症小体通路。本研究还采用NLRP3沉默基因 siRNA及Caspase-1抑制剂YVAD抑制NLRP3炎症小体的作用，探究炎症反应是否与NLRP3炎症小体的作用有关系。同时随着NLRP3炎症小体功能的阻断，下游的促炎物质IL-1β P17显著减少。此外，研究还发现NLRP3蛋白在si RNA抑制以后，NOX4蛋白的表达也明显降低，这个结果表明NLRP3和NOX4之间可能存在着一种相互影响的作用，而YVAD对NOX4蛋白的表达影响几乎没有改变。黄芪多糖的作用与NLRP3沉默基因 siRNA及Caspase-1抑制剂YVAD产生了类似的作用效果，可见黄芪多糖可通过抑制NLRP3炎症小体通路来抑制炎症，降低炎症因子的表达，抑制内皮细胞的凋亡，阻止内皮细胞的功能障碍。采用游离脂肪酸导致人血管内皮细胞产生炎症后，黄芪多糖可通过抑制NLRP3炎症小体表达，进而抑制Caspase-1生成，降低胞内炎症介质IL-1β活性片段生成，最终减少血管炎症的发生。其较好的抗炎效果对炎症疾病的治疗发挥着重要的作用。此外，黄芪多糖可提高免疫力、抗氧化、促进血管内皮增生、抑制肿瘤、保肝、调节血糖、防治脑血管损伤等作用[23-24]，使其具有更广阔的研究空间。现代中医学领域，对黄芪多糖的研究已达到细胞、分子层面，但是黄芪多糖提高机体抗炎能力的作用机制还未完全清楚，应对其进一步研究。