刘少强 陈 伟 刘伯龄 梁珪清▲ 齐 强

1.厦门大学附属福州第二医院脊柱外科，福建福州 350007；2.北京大学第三医院骨科，北京100191

脊柱融合（spinal fusion）是治疗脊柱疾病的主要方法之一，已成为治疗脊柱骨折、脊柱肿瘤、脊柱退行性病变和脊柱畸形的常规技术[1-3]。虽然采用联合内固定技术可减少融合失败的发生，但临床上不愈合率仍高达10%～15%，并导致疼痛、椎间隙塌陷、迟发性后凸畸形等并发症[2]。因此，如何有效地提高脊柱融合率和临床疗效，一直是脊柱外科医生亟待解决的问题。

非甾体抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）在脊柱外科手术后的疼痛管理中有广泛应用。有研究发现，NSAIDs 对骨折愈合有不利影响，如延长愈合时间、降低骨痂的机械强度和刚度、增加骨折不愈合率[4-7]。尽管上述学者报道了NSAIDs 药物对骨折愈合的影响，但均未直接模拟脊柱融合手术，且研究内容局限于生物力学研究，而缺乏组织学及免疫染色学等相关研究，因此尚无法阐明NSAIDs 药物对脊柱融合术后椎间植骨块中成骨细胞、骨形态发生蛋白形成的影响机制。

本研究拟以日本大耳白兔的脊柱融合为模型，术后给予不同类非甾体抗炎药，并于不同愈合期对椎体间植骨界面行组织学、影像学、生物力学进行定量比较，以研究不同药物对椎体间植骨融合的影响差异性，并阐明椎体间植骨融合的生物学关键环节和总体机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型

1.1.1 同种异体骨制备 选择成年雄性日本大耳白兔（健康8 月龄，体重2.5 ～3.0kg），以速眠新Ⅱ注射液0.2mL/kg 对实验动物进行肌肉注射以施行全身麻醉，常规皮肤消毒，在无菌条件下采集髂骨骨材，去除骨膜及周围软组织，洗净骨髓腔，1%新洁尔灭中浸泡30min，置入70%乙醇中浸泡及常温密封保存备用。

1.1.2 脊柱融合手术 麻醉成功后将其置于右侧卧位，左侧腰背部备皮，常规皮肤消毒。以肋缘下为标志确定L1水平，自肋骨下缘沿横突水平做长约5cm 横行切口，切开浅层肌肉，沿横突间肌肉肌间隙进入，暴露L3横突，用蚊式钳提拉L3横突及L4横突棘间韧带，充分暴露L3～4间盘。切除L3～4间盘组织，于椎间隙内植入已消毒好的同种异体骨。丝线逐层缝合周围软组织，包扎固定。术后分笼饲养，肌注青霉素40×104U/d，共3d。

1.1.3 分组 按数字随机化分为3 组：双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组，术后即刻开始服药。药物组中双氯芬酸钠、塞来昔布的用量按4mg/（kg·d）口服给药；为避免如胃肠道等不良反应，将药物研磨成粉，均匀分成三份，按早、中、晚混于饲料中，饲料标准为200g/d，连续药物喂养2 周；2 周后则正常饲料喂养。而对照组仅按相应重量进行饲料喂养，不给药物处理。

1.2 方法

1.2.1 组织学染色 在术后4、8、12 周分别取各组动物融合节段行大体标本。植骨融合节段于体积分数7%～10%甲醛脱钙液脱钙3 ～4 周，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红染色（HE 染色）检查，100 倍光镜下比较各组标本的骨痂生长情况，并依据Nilsson 骨愈合组织学评分标准[8]进行评分，见表1。

表1 Nilsson骨愈合组织学评分标准

1.2.2 影像学评估 在术后4、8、12 周，相同条件下（100cm，50kV，KODAK）拍摄所有标本侧位X 射线片，X 射线上融合融合标准为：（1）融合节段出现椎体前方、侧方连续骨桥形成或椎间连续骨小梁通过。（2）未出现融合节段透亮影、植骨下沉、终板和植骨面出现间隙等假关节形成的表现。根据Lane-Sandhu 骨愈合X 线评分标准[9]进行评分，见表2。

1.2.3 生物力学测定 在术后4、8、12 周，取所有标本，保留L3、L4、L5椎体，剔除肌肉、筋膜等软组织，保留融合骨结构，自椎体中央由前向后插入直径2.0mm 克氏针，使用电子拉力机（精度0.01N）进行融合节段（L3～4）及相邻未融合节段（L4～5）单向拉伸测试，拉伸负荷以1cm/min 的位移率通过克氏针施加于2 个节段，记录断裂时数值为该节段的最大拉伸负荷值。为减少实验动物间生理变异的影响，计算同一标本融合节段（L3～4）与相邻未融合节段（L4～5）的强度比值进行比较。

表2 Lane-Sandhu 骨愈合X线评分标准

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 16.0 统计软件进行分析。三组间的计数资料采用单因素方差分析（ANOVA），组间采用两两比较q 检验。检验水准α 值取双侧0.05。

2 结果

本研究成功建立了45 只雄性日本大耳白兔的脊柱融合动物模型，体重平均（2.83±0.18）kg。双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组各包含15 只动物模型。在术后4、8、12 周的每个时间节点，分别取各组5 只动物的融合节段制备标本，行组织学、影像学和生物力学评价。

2.1 组织学结果

按照Nilsson 骨愈合组织学评分标准对各实验兔进行评分，术后4 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的评分分别为（5.9±1.3）分、（6.0±0.9）分和（7.3±1.1）分，双氯芬酸钠组和塞来昔布组的评分显著低于对照组（P ＜0.05）。术后8 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的评分分别为（7.1±1.0）分、（9.3±1.5）分和（10.1±0.8）分，双氯芬酸钠组评分显著低于对照组（P ＜0.05），而塞来昔布组与对照组比较无统计学差异。术后12 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的评分分别为（9.7±0.8）分、（11.1±0.7）分和（12.3±0.9）分，双氯芬酸钠组评分显著低于对照组（P ＜0.05），而塞来昔布组与对照组比较无统计学差异。见表3。

表3 各组Nilsson骨愈合组织学平均评分 s，分）

表3 各组Nilsson骨愈合组织学平均评分 s，分）

注：与对照组比较，#P ＜0.05

组别 术后4周 术后8周 术后12周双氯芬酸钠组 5.9±1.3# 7.1±1.0# 9.7±0.8#塞来昔布组 6.0±0.9# 9.3±1.5 11.1±0.7对照组 7.3±1.1 10.1±0.8 12.3±0.9 F 9.821 20.390 6.379 P 0.031 0.027 0.019

2.2 影像学观察及评分

按照Lane-Sandhu 骨愈合X 线评分标准对各实验兔进行评分，术后4 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的评分分别为（3.8±1.1）分、（5.5±0.8）分和（6.3±1.2）分，双氯芬酸钠组和塞来昔布组的评分显著低于对照组（P ＜0.05）。术后8 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的评分分别为（6.4±0.8）分、（9.5±1.5）分和（11.0±0.9）分，双氯芬酸钠组评分显著低于对照组（P ＜0.05），而塞来昔布组与对照组比较无统计学差异。术后12 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的评分分别为（8.4±0.9）分、（10.5±1.4）分和（12.8±1.1）分，双氯芬酸钠组评分显著低于对照组（P ＜0.05），而塞来昔布组与对照组比较无统计学差异，见表4。

表4 各组Lane-Sandhu骨愈合X线平均评分分）

表4 各组Lane-Sandhu骨愈合X线平均评分分）

注：与对照组比较，#P ＜0.05

组别 术后4周 术后8周 术后12周双氯芬酸钠组 3.8±1.1# 6.4±0.8# 8.4±0.9#塞来昔布组 5.5±0.8# 9.5±1.5 10.5±1.4对照组 6.3±1.2 11.0±0.9 12.8±1.1 F 10.571 9.306 11.528 P 0.012 0.032 0.040

2.3 生物力学测定

测量各组实验兔的腰椎融合节段（L3～4）与相邻未融合节段（L4～5）的生物力学强度，并计算两节段的生物力学强度比值（L3～4/ L4～5），详见表5。术后4 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的生物力学强度比值分别为（1.6±1.0）、（1.7±0.8）和（2.0±0.8），双氯芬酸钠组和塞来昔布组显著低于对照组（P ＜0.05）。术后8 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的生物力学强度比值分别为（2.1±1.1）、（2.3±0.8）和（2.5±1.3），双氯芬酸钠组显著低于对照组（P ＜0.05），而塞来昔布组与对照组比较无统计学差异。术后12 周时双氯芬酸钠组、塞来昔布组和对照组的生物力学强度比值分别为（2.4±0.8）、（2.7±0.9）和（2.9±0.8），双氯芬酸钠组显著低于对照组（P ＜0.05），而塞来昔布组与对照组比较无统计学差异。

表5 各组的生物力学强度比值（L3～4/ L4～5）

3 讨论

脊柱的稳定性对于维持脊柱的正常功能非常重要，脊柱外科常采用植骨融合术来获得中远期的稳定效果。脊柱融合技术技术在过去的数十年间取得了很大成功。但脊柱融合术后骨不愈合时有发生，可导致疼痛、椎间隙塌陷、迟发性后凸畸形等并发症[10-11]。研究认为，脊柱融合术后植骨融合失效的原因包括技术因素、力学因素和生物学因素[12-13]。其中，生物学因素是急待解决的重点。由于整个植骨愈合过程可分为3 个阶段：炎症期、修复期和重塑期[14]。骨移植物植入之后，局部发生炎症反应，由此产生化学信号机因子趋化作用，宿主体内的免疫细胞进入植骨块，血管及基质逐渐形成并包绕植骨块，将多能干细胞输送至此，并在移植骨块内分化成熟，通过爬行替代的方法完成修复和重塑。

研究发现NSAIDs 药物缓解术后患者疼痛的同时，其还可抑制炎症过程中缓激肽的释放，干扰植骨炎症期的正常进行。Gerstenfeld 等[4]报道53 只闭合性股骨干骨折SD 雄性大鼠，骨折后随访分为4组，连续分别经口给生理盐水、酮咯酸、低剂量帕瑞昔布、高剂量帕瑞昔布组，发现NSAIDs 药物均降低骨痂的机械强度和刚度，造成骨折愈合延迟，其中非选择性NSAIDs 药物（酮铬酸）的影响更大，而选择性NSAIDs 药物（帕瑞昔布）的影响相对较小。该研究还观察对照组大鼠骨折部位的COX 表达情况，发现骨痂内COX-1 的表达在骨折后21d 均保持不变，而COX-2 在骨折后持续高表达到14d，后逐渐下降，在骨折后21d 回到基线水平。Akman 等[6]同样报道双氯芬酸可显著影响大鼠胫骨干骨折的愈合强度。陈坚等[5]报道常用非甾体抗炎药（阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸钠、美洛昔康、尼美舒利、塞来昔布）对成骨细胞增殖和骨形成蛋白有不同程度的抑制作用。

本研究发现术后4 周时，组织学、影像学和生物力学研究均表明双氯芬酸钠组和塞来昔布组实验兔植骨愈合劣于对照组，术后8、12 周时，塞来昔布组与对照组无显著差异，而双氯芬酸钠组仍劣于对照组。NSAIDs 药物的作用机制包括：（1）通过抑制环氧合酶活性，降低前列腺素的合成；（2）抑制淋巴细胞活性和活化的T 淋巴细胞的分化，减少对传入神经末梢的刺激；（3）直接作用于伤害性感受器，阻止致痛物质的形成和释放[15]。而环氧合酶包括COX-1 和COX-2 两种同工酶：COX-1 属于原生型酶，在正常生理状态下就存在于胃肠道、肾脏等部位，促进生理性前列腺素的合成，调节正常组织细胞的生理活动，如保护消化道黏膜，调节血管张力等；COX-2 属于诱生型酶，由损伤或炎症因子诱导生成，进而催化前列腺素合成，产生后续炎症反应以及疼痛[16-17]。作为非特异性NSAIDs 药物，双氯芬酸钠对COX-1 和COX-2 均有抑制作用，而塞来昔布作为特异性NSAIDs 药物，仅对COX-2 有抑制作用。因此，非甾体抗炎药物对植骨融合的影响存在差异，可能与NSAIDs 的药理机制不同相关。术后4 周时，选择性COX-2 和非选择性COX 抑制剂对脊柱椎间植骨融合均有负面影响，同时引起力学强度的减弱。术后8 和12 周时，选择性COX-2 非抑制剂对骨融合的负面影响消失，而非选择性COX抑制剂的负面影响仍存在。

根据本研究结果，脊柱椎间融合术后患者镇痛处理时，我们应注意避免过多使用非甾体抗炎药物（尤其非选择性COX 抑制剂），以免影响患者术后椎间植骨的愈合。