程子娟 叶桂山 戈玉梅 曹 娜 李肇蕤 刘漫君 朱 琳 夏春波▲

1.桂林医学院人体解剖学教研室，广西桂林 541004；2.桂林医学院附属医院，广西桂林 541001

荧光示踪剂具有灵敏性、可靠性及可同时追踪多重纤维联系的特点，是一类有效且应用前景广阔的神经通路追踪方法。其中伊文思蓝（Evans Blue，EB）和DiI[1]（1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocar- bocyanine perchlorate，DiI）是目前较为常见的荧光示踪剂，在神经示踪研究中均证明了其有效性，但两者示踪效果的详细特性和对比尚不清楚，在本项研究中，将EB 和DiI 注入大鼠海马进行标记，分析比较脑桥标记细胞的荧光强度和数目，为神经示踪研究提供客观参考和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

健康SD 大鼠40 只，体重（250±20）g，购于桂林医学院科学实验中心，合格证号：SCXK 桂2007-000。随机分成EB 组（n=20）和DiI 组（n=20）。

1.2 主要试剂和设备

EB、DiI 均 购 于 美 国Sigma 公 司，DMSO 购于上海碧云天生物有限公司，脑立体定向仪（日本SR-6），冰冻切片机（德国LEICA CM1860 UV），荧光显微镜（日本OlympusIX71FL）。

1.3 神经示踪剂注射

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3mL/kg），参照大鼠脑立体定位图谱，选取大鼠左侧海马坐标前囟后3.6mm，中线右旁开3.2mm，硬膜下3.5mm，用颅骨钻在注射点颅骨钻孔，分别缓慢注射DiI（2.5mg/mL，DMSO）和EB（5%，DIW）各0.3μL，留针10min。将大鼠饲养72h 后，再次麻醉，用钝针头自心尖处小于10°进针插入升主动脉固定，剪开右心耳，先迅速注入PBS 溶液400 ～500mL，使肝脏颜色变浅至发白，右心耳流出液无色后，4%多聚甲醛200mL 先快后慢灌注固定，随后立即取脑，置于4%多聚甲醛溶液中4℃条件下固定，24h 后梯度蔗糖脱水。

1.4 样本采集及镜下观察

将脱水完成的脑组织用游标卡尺测量后分段切取，常规冰冻切片，置于4℃冰箱湿盒避光保存。使用荧光显微镜观察注射部位脑切片，将注射点准确位于海马的大鼠脑切片分析，摒除定位不准或荧光剂溢出者。

1.5 统计学处理

同一高倍显微镜下荧光标记细胞数据采用SPSS 18.0 软件处理，用）表示计量资料，DiI 和EB 组荧光强度差异采用独立样本t 检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光标记细胞形态学观测结果

大鼠海马注射DiI，脑桥部见形态完整，轮廓清晰，对比鲜明的荧光标记细胞；注射EB，脑桥部荧光标记细胞轮廓不甚明朗，核未清晰显示，对比不明显。见图1。

图1 两种不同神经示踪剂追踪效果（0.3μL，×200，↓：脑桥标记细胞）

2.2 荧光强度测定结果

使用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统对同一解剖部位，5 个不同视野标记细胞进行计量、分析荧光强度，经SPSS 18.0 软件处理，t 检验分析DiI 和EB 组数据，结果显示DiI 组荧光强度高于EB 组，差异有统计学意义（P ＜0.01），两组标记细胞的数量差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 DiI和EB平均荧光强度和标记细胞数量测定结果

表1 DiI和EB平均荧光强度和标记细胞数量测定结果

3 讨论

目前研究显示，神经解剖束路追踪[2]可以阐明神经系统的解剖联系，借助示踪剂了解神经元之间的传导通路、鉴别特定神经轴突投射的目标神经元定位等[3]。随着荧光成像技术及敏感荧光示踪剂的发展为分析神经元回路提供了许多新的途径。现有神经示踪剂中，不同示踪剂的追踪效果差异较大，各有优缺点，选择合适的示踪剂，对神经通路研究十分关键。

DiI 作为最近引用的示踪剂，紫红色羰花青荧光染料，在549nm 激发光下可以产生发射波长为565nm 的红色荧光，1986 年Honig 等[4]首次确定DiI 可以示踪活体组织中的神经通路，其在固定组织中也可进行顺行和逆行示踪[5-6]。它荧光强，稳定可靠，无毒性，神经元的电生理几乎不受影响，有良好的神经轴突特异性，对周围纤维影响小，少见染料在细胞间迁移。DiI 已被广泛应用到生物体神经传导通路的示踪研究中[7-11]。EB 是早期发现的荧光示踪剂，常应用于示踪神经通路[12-13]和观察血脑屏障的完整性[14-15]，它在蓝光光波的激发下发出红色荧光，激发波长 545 ～580nm，发射波长 600nm，荧光显微镜下可直接观察，简便精确，是追踪神经通路的可靠方法。本研究分析比较DiI 和EB 两种荧光追踪剂的详细标记特性，为神经示踪研究提供实验依据。本实验采用脑立体定位技术将荧光标记物注入大鼠海马，有研究报道[12]注射EB 后，荧光剂扩散范围和注射体积有关。本实验注射荧光剂体积确定，将示踪剂定为唯一的变量，标记结果显示，两种示踪剂均可用于神经示踪，DiI 标记细胞形态完整，轮廓清晰，对比鲜明，持续较长时间不易淬灭。EB 标记神经元轮廓不甚明朗，从形态学上证实了DiI 的神经示踪效果优于EB，推测可能是由于DiI 的亲脂性及扩散方式与EB 有差异的缘故。此外，荧光标记在脑桥处效果更佳，与常丽荣等[16]的研究结果基本一致，再次证实了海马与脑桥的纤维联系。DiI 和EB 标记神经元数目无显著性差异，但DiI 组标记荧光强度显著高于EB 组。因此本研究认为DiI 较EB 而言可能更适合应用于神经形态学的研究，为神经定位、标记以及神经通路研究提供参考和依据。