崔玉琳， 白 松， 赵 娜， 范 越， 刘北星*

(1.中国医科大学基础医学院 免疫学教研室,辽宁 沈阳 110122;2.中国医科大学附属第四医院 检验科，辽宁 沈阳 110032;3.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是世界范围内婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体[1-3], 大多数感染者表现为轻微的上呼吸道疾病，但仍有2%～5%的儿童发生严重的毛细支气管炎并且需要住院治疗[4-6]。RSV感染导致机体产生炎症反应，从而激发宿主免疫应答发挥抗感染、清除病毒作用。研究表明，T细胞尤其是CD4+T细胞的活化及其气道内浸润数量直接影响RSV诱导的气道炎症的严重程度[7-8]。T 细胞活化需要双重信号的刺激：识别信号和刺激信号。OX40/OX40L是除 B7/CD28 和CD40/CD40L之外的另一对重要的协同刺激分子，在促进CD4+T 细胞的增殖、活化、记忆性 T 细胞的形成等方面具有重要作用[14]。 OX40(ACT35、CD134、TNFRSF4)属TNFR超家族成员，是相对分子质量约为47～51 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白。OX40主要表达于活化的CD4+T细胞[15],另外CD8+T细胞[16]、活化的调节性T细胞[17]、自然杀伤细胞[18]、中性粒细胞[19]等也可少量表达。利用OX40基因敲除鼠模型研究发现，缺少OX40导致小鼠体内抗原特异性CD4+T细胞数量显著减少，并降低其细胞因子分泌水平[20]。而在给予OX40激动型抗体的体内实验中，CD4+T细胞的效应显著增强，而且记忆性CD4+T细胞也发生明显的增殖[21],进一步显示了OX40在CD4+T细胞增殖与活化中的重要作用。但其是否参与RSV感染诱发的气道炎症中CD4+T细胞的增殖与活化，目前尚不清楚。本研究利用感染RSV的BALB/c鼠模型，通过流式细胞术、免疫磁珠分选、Real-time RT-PCR、Elisa、Western Blot等实验技术，探讨在RSV感染导致BALB/c鼠气道炎症的发生发展过程中，OX40在感染鼠CD4+T细胞增殖与活化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试动物、细胞株及病毒 动物：6～8周龄雌性BALB/c鼠，购自辽宁本溪长生生物技术有限公司，在中国医科大学实验动物中心SPF级动物饲养室内常规饲养2周后用于实验研究；细胞株：人喉癌上皮细胞系HEp-2为本实验室保存细胞株，用含10%FCS的RPMI-1640常规传代培养；病毒：人类呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2)，HEp-2 细胞增殖病毒，30%蔗糖超速离心法分离病毒粒子，-80 ℃冰箱保存。病毒滴度用组织细胞半数感染量50% (50% tissue culture infections dose，TCID50) 表示。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa生物工程有限公司；IL-2、IFN-γ和IL-13 ELISA 试剂盒购自R&D Systems 公司；FITC anti-mouse CD4、Percp anti-mouse CD3购自Biolegend公司；APC anti-mouse CD134(OX40)购自eBioscience公司；CD4+T Cell Isolation Kit mouse 购自美天旎公司；polyclonal anti-OX40 Ab购自R&D Systems 公司；Rabbit anti-Goat IgG-HRP购自爱必信生物科技有限公司；GAPDH Rb pAb、HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)购自万类生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备 CO2恒温培养箱(316108-5121，Thermo)，台式高速冷冻离心机(H2050R，湘仪离心机有限公司)，酶标检测仪(MoH 99-15，LM)，原位PCR仪(PTC-150TM，MJR),磁珠分选器(MiniMACS，Miltenyi)，流式细胞仪(FACSCelesta，BD)，实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)，自动化学发光成像系统(Tanon 5200)，高压蒸汽灭菌器(MLS-3751L，Panasonic)，超低温冰箱(SANYO)。

1.2 方法

1.2.1 感染模型 小鼠腹腔注射7.2%水合氯醛深度麻醉后，经鼻黏膜感染20 μL含2×106TCID50RSV的病毒悬液，感染后第3、7天收集实验标本，进行相关检测。

1.2.2 小鼠脾组织单细胞悬液制备 取脾组织，用两端弯曲的针头慢慢刮出脾细胞，制成单细胞悬液，利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。

1.2.3 细胞膜表面染色 将脾组织淋巴细胞浓度调整至1×106个/mL。分别加入单克隆抗体(FITC-anti-mouse-CD4、PerCP-anti-mouse-CD3、AP-C-anti-mouse OX40)，避光冰浴30 min，流式细胞仪检测分析OX40+CD4+T cells 细胞的百分比及数量。

1.2.4 CD4+T 细胞的分选和体外培养 CD4+T Cell Isolation Kit mouse磁珠分选试剂盒无菌分选感染后3 d鼠脾CD4+T细胞，调整浓度为1×106个/ 200 μL， 接种于96孔板中并加入OX40激动型抗体(1 μg/mL)，24 h后收取细胞及上清。

1.2.5 Real-time RT-PCR技术检测细胞因子 用RNAisoplus试剂盒提取CD4+T细胞的总RNA，PrimeScriptTM逆转录试剂盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒说明，采用Real-time RT-PCR技术检测CD4+T细胞表面的OX40膜分子及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13的mRNA表达水平。引物设计：OX40-F,5′-GGCCCTGCATTTGCTGTTCT-3′；OX40-R,5′-AGGATATGGGTTGTCCGTGC-3′；IFN-γ-F,5′-TATCTGGAGGAACTGGCAAA-3′；IFN-γ-R,5′-GGTGTGATTCAATGACGCTT-3′；IL-2-F,5′-CTGCGGCATGTTCTGGATTT-3′；IL-2-R,5′-GAAAGTCCACCACAGTTGCT-3′；IL-13-F,5′-AGCATGGTATGGAGTGTGGA-3′；IL-13-R,5′-TTGCAATTGGAGATGTTGGT-3′；β-actin-F,5′-GGTCATCACTATTGGCAACG-3′；β-actin-R,5′-TCCATACCCAAGAAGGAAGG-3′在ABI 7500系统下进行实时荧光定量PCR扩增。结果表示为2-ΔΔCT(fold change)。

1.2.6 ELISA测定培养上清中细胞因子水平 ELISA试剂盒检测培养上清中IL-2、IFN-γ和IL-13的含量。以 IL-13 细胞因子为例，大致实验流程：根据试剂盒说明书配制 IL-33 捕获抗体，每孔 100 μL，4 ℃孵育过夜；配制洗液(即 0.05%Tween-20 的 1×PBS)，每孔 250 μL 洗液，洗板 3 次；配制封闭液，每孔 250 μL，室温孵育 1h；洗板 3 次；按照试剂盒说明书配制 IL-13 标准品，每孔 100 μL，在余下的 ELISA 反应孔内加入 100 μL 待检测培养上清原液，4 ℃孵育2 h；洗板 3 次；配制生物素标记的抗 IL-13 的单克隆抗体(即检测抗体)，每孔 100 μL，室温孵育 2 h；洗板 3 次；配制亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)，每孔 100 μL，室温孵育 20 mins；洗板 6 次；加入 TMB底物，每孔 100 μL，室温避光反应 20 mins；加反应终止液，每孔 50 μL；酶标仪读板，将波长设定为 450 nm，记录OD值；使用 SoftMax Pro7 软件绘制各细胞因子的标准曲线，并由此标准曲线计算出相应的细胞因子浓度。

1.2.7 Western Blot 技术检测蛋白分子 磁珠分选脾组织CD4+T细胞，预冷的无菌PBS溶液洗涤细胞2遍，加入200 μL含有PMSF的RIPA蛋白裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100),置于冰上裂解30 min。5×蛋白上样缓冲液处理样品，100 ℃加热5 min以充分变性蛋白，SDS-聚丙烯酰胺(10%)凝胶电泳，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，加入OX40 Ab(R&D Systems)，GAPDH Ab(Wanleibio)4 ℃孵育过夜，第2天与相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(Rabbit anti-Goat或Goat anti-Rabbit)结合室温孵育1 h。最后，用自动化学发光成像系统(Tanon 5200)检测蛋白条带。

2 结果与分析

2.1 RSV感染增加BALB/c鼠脾组织内CD4+T细胞及OX40+CD4+T细胞数量

RSV经鼻感染BALB/c鼠后不同时间点，收集标本。流式细胞术检测发现，与正常对照组相比，RSV感染鼠脾组织内CD4+T细胞及OX40+CD4+T细胞数量明显增多。感染第3天其CD4+T细胞和OX40+CD4+T细胞绝对数均达到峰值，之后虽有下降，但感染后第7天其数量仍然明显高于对照组(图1)。

2.2 RSV感染鼠脾组织内CD4+T细胞的OX40 mRNA及蛋白表达水平

利用免疫磁珠分选BALB/c鼠脾CD4+T细胞，Real-time RT-PCR检测其OX40 mRNA表达水平，结果发现，RSV感染导致脾CD4+T细胞OX40 mRNA水平显著上升，感染后第3天最为显著，之后虽有下降，但感染后第7天仍处于较高水平(图2)。同时利用Western Blot 技术进一步验证了RSV感染对脾CD4+T细胞OX40表达的影响。结果显示感染后第3天其CD4+T细胞OX40蛋白表达水平明显增强，感染后第7天略有下降，但仍高于正常对照组(图3A、B)，提示OX40可能参与CD4+T细胞的增殖与活化。

图1 RSV感染鼠脾组织内CD4+T细胞及OX40+CD4+T细胞数量的变化Fig.1 The absolute number of CD4+T cells as well as OX40+CD4+T cells in the spleens of mice during RSV infectionA：脾组织CD4+T细胞总数；B：脾组织OX40+CD4+T细胞数量；C：脾组织OX40+CD4+T细胞流式散点图；* 与正常对照组组相比,P<0.05；图2、3同A: CD4+T cells in the spleen; B: OX40+CD4+T cells in the spleen; C: representative flow cytometry plots for OX40+CD4+T cells；* Significant difference (P<0.05, by ANOVA), compared with the normal control group，图2、3同

图2 RSV感染影响BALB/c鼠脾组织内CD4+T细胞OX40 mRNAs的表达Fig.2 The expression of OX40 mRNAs in splenic CD4+T cells during RSV infection

2.3 OX40介导RSV感染鼠脾组织内CD4+T细胞细胞因子表达

为明确OX40是否参与RSV感染鼠脾CD4+T细胞的活化，从感染第3天的BALB/c鼠脾组织中分选CD4+T细胞，接种于96孔板中并加入OX40激动型抗体anti-mouse OX40(1 μg/ mL)。体外培养24 h后收集CD4+T细胞并提取总RNA, 检测其细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13 mRNA的表达水平。Real-time RT-PCR结果显示，与CD4+T细胞单独培养组相比，加入OX40激动型抗体的CD4+T细胞组，其细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13mRNA表达水平均显著增高(图4A)，同时，检测培养上清中细胞因子的表达水平，结果显示IL-13表达水平显著增高(图4B),证实OX40参与CD4+T细胞的活化及其细胞因子分泌。

图3 RSV感染鼠脾组织内CD4+T细胞OX40 蛋白表达水平的变化Fig.3 The expression of OX40 proteins in splenic CD4+T cells during RSV infection

图4 OX40激动型抗体促进RSV感染鼠脾CD4+T细胞IL-2、IFN-γ及IL-13 细胞因子表达Fig.4 Agonist anti-OX40 can enhance the cytokines expression of IL-2、IFN-γ and IL-13 in splenic CD4+T cells during RSV infectionA：脾组织CD4+T细胞IL-2、IFN-γ 和 IL-13 mRNAs表达量；B：脾组织CD4+T细胞培养上清中细胞因子IL-2、IFN-γ 和 IL-13表达量;* 与CD4+T细胞单独培养组相比,P<0.05A: IL-2，IFN-γ and IL-13 mRNAs expression in splenic CD4+T cells; B: IL-2，IFN-γ and IL-13 cytokines expression in splenic CD4+T cells culture supernatant；* Significant difference (P<0.05, by t tests), compared with the CD4+T cells cultured alone group

3 讨 论

呼吸道合胞病毒是秋冬季节引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体，几乎所有儿童在2岁之前均感染过RSV[1-6]。Graham等[9]发现阻断CD4+T细胞可明显减轻呼吸道合胞病毒感染诱导的肺炎症反应，另外Sealy等[10]发现：同回输CD4+T细胞的RSV感染小鼠相比，缺少CD4+T细胞的RSV感染小鼠其体内病毒清除时间明显延长，并且血清特异性抗体IgA及IgG含量显著减少，这表明CD4+T细胞在清除RSV病毒及诱导产生特异性抗体中发挥着重要作用。CD4+T细胞主要通过活化之后产生的一些细胞因子参与调节RSV诱导的气道炎症，如IL-2、IFN-γ、IL-13等[7-10]。IL-2又称T细胞生长因子,具有促进T细胞增殖、调节NK细胞、诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖的作用[11]。IFN-γ不仅具有调节嗜酸性粒细胞的活化、分化和募集的作用，在一定程度上也能够抑制IgE生成，促进IgG的合成[12]。IL-13在促进黏液分泌，诱导气道纤维化等方面具有重要作用[13]。

TNFR/TNF超家族成员在调节免疫功能中扮演着重要角色，以往的研究表明OX40/OX40L作为这个家族中最重要的成员之一，能够使激活的初始T细胞增殖和分化为效应T细胞和记忆T细胞， 在调节CD4+T细胞的增殖与活化中占重要地位[14-15，20-21]。OX40可以通过其胞内段与TNFR重要的相关因子(TRAF 2、3、5)相互作用，而TRAF 2和3被认为是可以激活NF-κB1经典途径以及NF-κB2非经典途径的关键信号分子[22-23]。OX40通过激活NF-κB1途径，影响CD4+T细胞对抗原的应答及其分化与增殖[24]。缺少OX40基因的CD4+T细胞其NF-κB1活性明显减弱，导致Bcl-2家族相关蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Bfl-1)表达水平下调，进而影响CD4+T细胞的增殖与存活[25]。OX40还可以激活NIK以及诱导IKKα磷酸化，从而激活NF-κB2非经典途径。

研究表明OX40主要表达在炎症浸润部位的T细胞上, 而在非炎症部位几乎不表达，其生物学功能主要限于效应性CD4+T细胞。它可促进CD4+T细胞增殖，诱导其产生细胞因子，增强其效应功能，促进记忆性T细胞的形成，延长T细胞的存活时间，在机体的免疫及自身免疫中发挥重要的调节作用[21，26]。在探讨OX40通过CD4+T细胞调节压力过负荷诱导的心脏肥厚和重塑的研究中发现：与野生鼠相比，OX40基因敲除鼠心肌肥厚症状明显缓解，并且其CD4+T细胞的TNF-α、IFN-γ、IL-2因子分泌水平显著下降[26]；在OVA致敏引起的哮喘实验模型中发现：相比于对照组，给予OX40激动型抗体的实验组其CD4+T细胞IFN-γ、IL-4因子分泌水平显著增高[21]，表明OX40在促进CD4+T细胞的增殖与活化中具有重要作用。

本研究发现RSV感染鼠脾组织内CD4+T细胞数量以及表达OX40的CD4+T细胞数量明显增多，并且CD4+T细胞的OX40 mRNA及蛋白分子表达量也显著增高，提示OX40在呼吸道合胞病毒感染所诱发的气道炎症反应中对CD4+T细胞增殖与活化具有一定作用。另外在体外培养实验中，给予OX40激动型抗体的CD4+T细胞其细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13的表达水平均显著增高，提示在RSV感染过程中OX40能够促进CD4+T细胞的增殖与活化。近年来，除了许多其他T细胞调节受体，OX40已成为单克隆免疫治疗的靶点抗体[27-29]。随着对其免疫学生物特性及功能的了解, 有望为炎症性等疾病带来新的前景。

本研究利用感染RSV的BALB/c鼠模型，通过体内外实验证实在RSV感染所诱发的气道炎症反应中OX40能够促进CD4+T细胞的增殖与活化。