刘 昕 孙毅海* 唐 深 陶卫琦 李少红 黄才胜 黄超斌 黄慧宁 谢 阳

(1 广西南宁市第二人民医院泌尿外科，南宁市 530031；2 广西医科大学基础医学院，南宁市 530021)

随着泌尿外科腔内技术的发展，临床上越来越多的患者接受腔镜手术治疗，包括输尿管镜、钬激光技术。随之而来的医源性输尿管损伤也逐渐增多，输尿管损伤后出现的输尿管狭窄是泌尿外科较为棘手的临床问题之一。输尿管狭窄的形成以及治疗后狭窄复发，也成为泌尿外科医师亟待解决的困扰[1]。本实验采用定量反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术测定正常兔输尿管以及钬激光损伤后兔输尿管的瘢痕生成相关的转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达水平，以探讨钬激光输尿管热损伤导致瘢痕狭窄的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 以10只成年新西兰二级大白兔为实验对象，重量2.5～3.0 kg，年龄4～6个月。RNAlater、TRIzol等RNA保存和抽提试剂购自Life Technologies公司，引物合成、荧光定量PCR等分子生物学试剂购自Takara公司。主要仪器有岛津Biospec-nano微量蛋白核酸检测仪、罗氏480定量PCR仪、Bio-Rad水平电泳系统、Bio-Rad梯度PCR仪、ProteinSimple凝胶成像系统。

1.2 方法 丙泊酚1.5 mg·min-1·kg-1经兔耳缘静脉微泵注入，持续静脉麻醉。麻醉后取俯卧位，右侧背部术野备皮，用碘伏消毒术野皮肤,铺无菌手术巾，取右侧腰部纵向切口，长约5 cm，依次切开皮肤、皮下，钝性分离肌肉层，从腹膜后游离右肾盂及输尿管。7号注射器针头穿刺证实有尿液流出后，经针头置入200 μm钬激光光纤，钬激光功率设置为10 W，对输尿管壁环形烧灼。随后退出针头及光纤，缝合肌层及皮肤切口。术中静脉注射青霉素80万单位。术后饲养3周，每天用碘伏清洗伤口1次，直至伤口愈合。皮肤缝线无须拆除，伤口愈合后可自行脱落，术后1只因伤口漏尿致感染死亡，1只因术中麻醉过深而死亡。

1.3 标本采集及检测 饲养3周后处死，经腹切口取出患侧(钬激光损伤组)及健侧(对照组)肾脏和输尿管，行RT-PCR定量检测TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及α-SMA水平。检测步骤：(1)合成引物；(2)利用Trizol法抽提总RNA，电泳法检测RNA完整性，测量RNA的OD260、OD280吸光度值；(3)逆转录合成cDNA；(4)荧光定量PCR引物测试；(5)SYBR Green法实时定量PCR检测各基因表达水平。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法分析比较基因的表达差异。ΔΔCt=钬激光损伤组(Ct目的基因-Ct内参基因)-对照组(Ct目的基因-Ct内参基因)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 琼脂糖电泳 各样本总RNA的3条电泳带清晰，28S rRNA较18S rRNA约高出一倍，提示组织样本未发生降解，取材良好；且各样本紫外分光光度法测试核酸OD260/280吸光度值比值均在1.8～2.1。上述实验结果显示各样本抽提获取的总RNA完整性好，符合后续的荧光定量PCR检测各基因mRNA表达水平的要求。如图1。

M：DNA marker(Takara DL2000)1：对照组 2：钬激光损伤组图1 兔输尿管RNA琼脂糖电泳图

2.2 荧光定量PCR引物溶解曲线测试 各引物的溶解曲线均为单一峰，引物扩增特异性等符合荧光定量PCR实验要求。见图2。

TGF-β1 TGF-β2

TGF-β3 α-SMA

2.3 定量PCR检测结果 钬激光损伤组TGF-β1、TGF-β2、α-SMA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)，且α-SMA表达增幅比TGF-β1、TGF-β2更高。而两组TGF-β3表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 兔输尿管相关基因荧光定量PCR检测结果

3 讨 论

输尿管狭窄是泌尿外科较为棘手的问题之一，严重的狭窄可导致患侧上尿路梗阻，进而使肾功能受损甚至丧失。大多数输尿管狭窄为后天性狭窄，往往是由于输尿管损伤所致。临床上常见的输尿管损伤为输尿管结石损伤、盆腔手术损伤、输尿管腔内手术损伤、肿瘤放疗损伤等。随着泌尿外科腔内技术的发展及钬激光技术的应用，输尿管腔内操作或手术导致的输尿管损伤逐渐增多，因此，输尿管腔内损伤并狭窄形成机制的研究，以及探讨干预狭窄形成的方法将对临床工作具有重要的指导意义。

近年来，随着钬激光在泌尿外科中应用的普及，其已经成为泌尿外科治疗的首选激光。钬激光以其对软组织精确的消融、气化、切割、凝固、止血的作用，在临床各科得到了广泛的应用，尤其在泌尿外科的经腔道治疗中具有不可替代的优势，目前多用于泌尿系统结石碎石、肿瘤消融、前列腺切除、输尿管及尿道狭窄瘢痕切开等手术[2]。但是由于激光的光热效应，对组织可造成热损伤，在应用于输尿管结石的碎石过程中，若操作不慎，可对输尿管黏膜、肌层甚至浆膜层造成损伤。损伤后输尿管组织在自我修复过程中形成的增生性瘢痕组织，是输尿管损伤性狭窄的病理基础。

研究表明，TGF-β在成纤维细胞中的高表达，是与瘢痕形成关系最为密切的细胞因子[3]。类似的研究发现，TGF-β1、α-SMA与胆道损伤后瘢痕增生、狭窄形成有明确的关系[4]。TGF-β分为3个亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它们在体内具有不同的功能以维持相互之间的机体平衡，这种平衡的失调将导致组织器官纤维化。而α-SMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白，是瘢痕收缩的物质基础。本实验结果中，输尿管钬激光损伤后，瘢痕形成的输尿管平滑肌中TGF-β1、TGF-β2、α-SMA表达较正常输尿管明显升高(P<0.05)，提示热损伤增加了输尿管平滑肌成纤维细胞中TGF-β1、TGF-β2、α-SMA的表达，从而导致平滑肌瘢痕形成及输尿管狭窄。在体外培养的瘢痕成纤维细胞中，TGF-β1、TGF-β2可促进瘢痕成纤维细胞增殖，增强纤维蛋白和胶原分泌。有研究发现，使用激光、双氢青蒿素等物理或化学方法降低TGF-β1的分泌量可以抑制瘢痕成纤维细胞的形成[5-6]。

对于输尿管热损伤后TGF-β3表达无明显变化的结果，可能意味着TGF-β3不参与瘢痕形成过程。相关研究表明，TGF-β3可能有拮抗TGF-β1、TGF-β2及抑制瘢痕形成的作用[7]。输尿管损伤后α-SMA的高表达，与TGF-β1、TGF-β2的表达有关。研究表明TGF-β1、TGF-β2对α-SMA的表达有促进作用[8]。

通过对输尿管钬激光损伤后相关瘢痕因子的动物实验结果表明，TGF-β1、TGF-β2、α-SMA的高表达与钬激光输尿管损伤狭窄发生密切相关。因此，在输尿管腔内钬激光操作的过程中应避免或减少钬激光对输尿管的损伤，或者通过调控TGF-β亚型及α-SMA的表达减少输尿管狭窄的发生。