韩 萍，杨雪枝，赵英杰，张冰洁，李丝雨，张斌斌，常 艳，魏 伟

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种复杂的自身免疫病，特征是慢性滑膜炎症和关节破坏，发病机制尚不清楚[1]。色氨酸(L- tryptophan, Trp)是人体必需氨基酸，可以调节适应性免疫[2-3]，多数Trp代谢是沿着犬尿氨酸(L- kynurenine, Kyn)途径代谢的，该途径产生Kyn及一系列代谢产物，参与炎症免疫反应[4]。大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)模型在病理机制等方面与人的RA相似，是研究RA较为理想的模型之一[5]。本实验通过建立AA模型，检测正常和模型大鼠血清中Trp和Kyn含量变化，目前主要采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)检测Trp和Kyn的含量[6-7]，在制备标准曲线等时对使用的血清进行了透析，此法可在同时测定Trp和Kyn的条件下，减少干扰因素。

1 材料与方法

1.1 样本动物为健康雄性SD大鼠20只，合格证号：[SCXK(皖)2017-001]，体质量(170±20)g，购自安徽医科大学实验动物中心。样本的收集AA大鼠成模后处死取血于15 ml离心管中，静置2 h后，2 000 r/min离心20 min，取上清液，并于-20 ℃保存。

1.2 仪器Agilent1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Sigma 3- 30K高速冷冻离心机(上海纳腾仪器有限公司)；AA- 200DS电子分析天平(美国Denver仪器公司)；Amicon Uitra- 0.5超滤离心机(美国Millipore公司)。

1.3 试剂L- Trp(WXBC4097V)、L- Kyn(BCBT1074)购自德国SIGMA- ALORICH，纯度≥98%；冰醋酸(20170106)、醋酸钠(20170320)、高氯酸(20170204)均为分析纯，购自中国医药集团化学试剂有限公司。

1.4 AA大鼠模型的制备将大鼠随机分为两组，即对照组和模型组，每组10只。将 BCG 80 ℃水浴灭活1 h，与经过高压灭菌的石蜡充分研磨，制成10 mg/ml完全弗氏佐剂(complete freund adjuvant,CFA)，于大鼠右后足跖皮内注射CFA 0.1 ml致炎[8]，正常组用生理盐水同法注射。

1.5 溶液的配制

1.5.1储备液配制 精密称取L- Trp对照品40.90 mg，L- Kyn对照品2.08 mg，用体积百分比为2.5%的高氯酸溶解，定容至10 ml容量瓶中，得浓度20 000 μmol/L、1 000 μmol/L对照品储备液，4 ℃保存，用时稀释。

1.5.2流动相溶液配制 精密称取醋酸钠4.922 8 g, 加纯水溶解于100 ml容量瓶中定容，制成600 mmol/L储备液。用时加纯水稀释得15 mmol/L溶液，冰醋酸调节pH至4，再用0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.5.3血清透析 将透析袋在体积2% (w/v) NaHCO3和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10 min，再放在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，冷却后放于4 ℃。将需要透析的血清装入透析袋，放入KrebsRinger磷酸盐缓冲液[78.1% NaCl溶液，2.3% CaCl2-2H2O溶液，3.1% KCl溶液，0.8% MgSO4-7H2O，15.6%Na2HPO4-HCl缓冲液(pH 7.4)]中，血清：缓冲液(1 ∶25，v/v)，于4 ℃透析36 h，缓冲液每8～10 h更换1次，至少更换3次。

1.5.4供试品溶液的配制 取透析血清100 μl于离心管中，加入100 μl 5%高氯酸，充分混匀，14 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取20 μl进样。

1.6 色谱条件色谱柱：Agilent TC- C18(250 mm×5 mm, 5 μm)；流动相 ∶乙腈 ∶醋酸钠(体积百分比8 ∶92)；流速1.0 ml/min；Trp紫外检测波长：280 nm；Kyn紫外检测波长:360 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2 结果

2.1 AA大鼠模型的建立模型组大鼠在免疫后第14天出现继发病变，出现足爪红肿，体质量减轻，全身评分、关节炎指数、关节肿胀数和足爪肿胀度明显增加，与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1～6。

图1 肉眼观察大鼠足爪肿胀

2.2 HPLC方法学结果

2.2.1专属性实验 在1.6项色谱条件下分别对空白血清、空白血清加对照品溶液、供试品溶液进样分析，Trp保留时间9.0 min，Kyn保留时间5.6 min，峰形良好，样品中其他内源性物质不干扰测定，与杂质分离良好。结果见图7～9。

图2 大鼠全身评分

图3 大鼠关节炎指数

图4 大鼠关节肿胀数

图5 大鼠足爪肿胀度

2.2.2线性关系考察

2.2.2.1Trp标准曲线 取20 000 μmol/L Trp对照品储备液，加入空白血清中，使Trp浓度分别为25、50、100、250、500、1 000 μmol/L，并按1.5.4中供试品溶液处理后进行HPLC分析。以加入对照品溶液样品峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得标准曲线方程，Trp:Y=2.387 8X-6.893 5,R2=0.999 8, Trp在25～1 000 μmol/L范围内线性关系良好。见表1。

2.2.2.2Kyn标准曲线 取1 000 μmol/L Kyn对照品储备液，加入空白血清中，使Kyn浓度分别为0.5、1、2、5、10、20 μmol/L，并按1.5.4中供试品溶液处理后进行HPLC分析。得标准曲线方程，Kyn:Y=2.753 8X-1.156 6,R2=0.999 3, Kyn在0.5～20 μmol/L范围内线性关系良好。见表2。

图6 大鼠体质量变化

表1 Trp标准曲线

图7 空白血清Kyn和Trp色谱图

编号123456浓度(μmol/L)0.51251020峰面积0.96±0.271.68±0.424.94±0.1512.80±0.7025.88±1.7154.20±2.33

图8 空白血清外加对照品色谱图

2.2.3检测限和定量限 在血清中加入一定量的对照品溶液，按1.5.4项中样品处理方法进行HPLC分析并做3次平行实验。按信噪比(S/N)为3计检测限，Trp、Kyn检测限分别为0.27 μmol/L、0.07 μmol/L；按S/N为10计定量限，Trp、Kyn定量限分别为0.83 μmol/L、0.56 μmol/L。

2.2.4回收率(准确度)试验 取Trp和Kyn对照品溶液加入到空白血清中制成低、中、高3个浓度的标准血样，处理后进行HPLC分析，每个浓度1 d内平行配制3个样品，测定回收率，Trp回收率为96.71%～112.58%，Kyn回收率为92.60%～117.82%。见表3。

表3 Trp和 Kyn回收率

图9 实际样品Trp和Kyn色谱图

活性物质浓度(μmol/L)日内精密度实际样品浓度(μmol/L)RSD(%)日间精密度实际样品浓度(μmol/L)RSD(%)Trp5054.13±2.684.9553.65±2.414.49250242.39±3.451.43244.57±4.021.65500812.96±29.763.67816.58±26.733.27Kyn11.090±0.0978.901.100±0.0837.5555.756±0.1462.545.690±0.1332.341012.009±0.2812.3411.893±0.3723.13

2.2.5精密度试验 取Trp和Kyn对照品溶液加入空白血清中制成低、中、高3个浓度标准血样，每个浓度水平1 d内平行配制3个样品，测定日内精密度，每个浓度水平3 d内测定3次，计算日间精密度。Trp和Kyn相对标准偏差(RSD)均小于15%，符合样品分析要求。见表4。

2.2.6稳定性试验 取Trp和Kyn对照品溶液加入血清中，供试品分别在4 ℃、25 ℃下放置。将供试品分别在0、4、8、12、16、20、24 h测定Trp和Kyn含量考察其稳定性，结果表明样品在4 ℃和25 ℃均可稳定放置24 h，稳定性较好，符合生物样品稳定性测定的要求。

2.3 实际样品中Trp和Kyn测定用上述建立的方法测定了正常组和模型组大鼠血清中Trp和Kyn浓度。经分析，模型组和正常组的差异有统计学意义(P<0.01)，与正常组比较，Trp的浓度降低，Kyn的浓度升高，Kyn/Trp比值升高。见表5。

表5 实际样品测定结果

与正常组比较：**P<0.01

3 讨论

由于Kyn代谢与炎症免疫之间有着密切的关系，Kyn已成为RA等多种疾病的参与者[9]。在正常机体中，Trp和Kyn维持着一个动态平衡，但当体内的Trp和Kyn含量变化时，机体会诱发各种疾病，例如自身免疫病或恶性肿瘤等[4,10]。吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine2,3- dioxygenase,IDO1) 是此代谢通路的限速酶之一，目前大多数的研究是采用测定Kyn和Trp比值来评价IDO1的活性[11]，定量测定体内Trp和Kyn浓度为诊断相关疾病提供了重要的依据。

大鼠体内的Trp和Kyn均为内源性物质，建立方法学时需采用不含待测物的空白血清，排除血清自身Trp和Kyn对定量测定的干扰，本实验采用Krebs- Ringer磷酸盐缓冲液进行血清透析，可获得不含或含极少量内源性物质的空白血清样本。为了更进一步提高测定的准确性，还采用了标准加入法对Trp和Kyn进行检测[12]。用HPLC测定血清中Trp、Kyn时需去除血清中的蛋白，本实验采用高氯酸蛋白沉淀法，无需衍生化处理与梯度洗脱，并与之前文献[13]报道相比保留时间缩短，节约时间。本实验流动相中乙腈的比例调到8%，相对于乙腈比例为3%或4%峰面积响应值增大，保留时间缩短。流速太小，峰面积响应值小，出峰时间较长，但流速太大，柱压较大，最终采用1.0 ml/min的流速。

随着对Trp、Kyn及其他代谢产物的的深入研究发现，Kyn是此代谢通路上极为重要的中间代谢物，在多种疾病中有重要作用，与疾病发展密切相关[14]，检测Trp和Kyn浓度变得极为重要。结果表明，与对照组比较，AA大鼠Trp和Kyn及其比值都有显著变化，Trp浓度降低，Kyn浓度升高，Kyn/Trp升高，提示Trp- IDO1- Kyn代谢通路异常可能参与RA的发生发展。HPLC有准确、灵敏度高等特点，是现阶段检测Trp和Kyn含量的主要方法。经过本实验实际应用，只需将血清去除蛋白，无需柱前衍生化即可进行测定，且专属性、线性范围、检测限、定量限、准确度、精密度、稳定性等方法学指标均符合测定要求，适用于大鼠体内Trp和Kyn含量测定。