戴永铮，钱成炜，徐小立，蒋 勇

口腔鳞状细胞癌复发率高、生存周期短，手术治疗的局限性造成治疗效果差，因而新的治疗方法对提高患者生存率具有重要意义。电压门控钠离子通道(voltage- gated sodium channel，VGSC)是一种跨膜糖蛋白，由一个α亚基和多个β亚基组成。根据α亚基的不同可将其分为9种，即Nav1.1- Nav1.9[1]。近年来一些研究发现， Nav1.5在包括前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、宫颈癌[5]和非小细胞肺癌[6]等多种肿瘤中高表达，对肿瘤的增殖、侵袭等生物学过程具有明显的调节作用。在口腔鳞癌中，研究[7]显示Nav1.5在癌组织中的表达相比正常组织明显升高，但其在口腔鳞癌中的表达调控机制研究甚少。该研究通过检测Nav1.5的表达水平变化以及在增殖和侵袭中具有重要作用的相关蛋白检测，来分析其对口腔鳞癌细胞增殖和侵袭的作用，为口腔鳞癌的靶向治疗寻求新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自以色列Biolnd公司；胰酶消化液、细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、 RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Nav1.5多克隆抗体购自美国Abcam公司；基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP- 2)、 MMP- 9多克隆抗体购自美国santa cruz公司；山羊抗鼠、抗兔IG抗体购自北京中杉金桥公司；CCK8试剂盒购自日本同仁公司；PCR引物购自上海生物工程股份有限公司；逆转录试剂盒、 实时荧光定量PCR(Real Time- PCR，RT- PCR)试剂盒购自日本Takara公司； PVDF 膜购自美国Invitrogen公司；Matrigel胶、Transwell小室购自美国Corning公司；siRNA- Nav1.5购自上海吉玛公司；lipo2000、CO2恒温孵箱购自美国Thermo Fisher公司；RT- PCR仪购自美国Stratagene公司；酶标仪购自美国Bio- tek公司。收集安徽医科大学第一附属医院口腔颌面外科口腔鳞癌组织(2例)和正常口腔黏膜组织(牙龈2例)，标本取下直接保存于-80 ℃备用。

1.2 实验方法

1.2.1组织免疫组化 4%甲醛固定组织6 h，石蜡包埋，4 μm厚切片，60 ℃烤片4 h，脱蜡至水，抗原修复，3% H2O2室温孵育10 min，1 ∶200稀释Nav1.5一抗4 ℃孵育过夜(16 h左右)，HRP二抗37 ℃、 30 min，DAB显色，苏木精复染，封片，镜下观察。

1.2.2细胞培养 HSC- 3细胞在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素DMEM培养基中，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养。每3 d传代一次。

1.2.3免疫荧光实验 将细胞以5×105个/ml的密度接种于共聚焦小皿，孵箱过夜。4%多聚甲醛室温下固定30 min，0.5% Trixton X- 100室温下穿通20 min，1% BSA封闭细胞30 min， 加入Nav1.5的一抗(6 μg/ ml)冰箱孵育24 h，次日室温孵育1 h。 加入罗丹明标记的二抗(1 ∶50)避光孵育2 h，DAPI(1 ∶2 000)避光孵育8 min。在Zeiss LSM510共聚焦成像系统下观察细胞。

1.2.4siRNA转染实验 美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)上查找Nav1.5的序列，根据目的基因序列设计合成3条Nav1.5的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)组，以及一条阴性对照(negative control，NC)组，同时设置空白对照(control，CON)组，序列见表1。转染前1 d，将2×105个/ml细胞接种于培养板中，每孔中加入约500 μl无抗生素的培养基。取1 μl/孔lipo2000，用50 μl opti- MEM无血清培养基稀释，并室温孵育5 min。取2 μl siRNA，以50 μl opti- MEM无血清培养基稀释，混匀。2种液体轻轻混匀，室温静置20 min。加入含有细胞及培养液的孔中，混匀。转染6 h后，换为含血清的完全培养基。见表1。

1.2.5RT- PCR检测 按TRIzol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，使用PrimeScriptTM- PCR kit逆转录试剂盒逆转录成cDNA，然后以此为模板，用目标基因的引物进行扩增和检测。反应条件：95 ℃、1 min，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s。每个样品设置3个复孔，PCR的所有引物均由上海生物工程公司进行设计合成，序列见表2。

表2 引物序列

1.2.6Western blot 检测 用RIPA细胞裂解液提取各组细胞总蛋白。BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，调整各组浓度一致后，99 ℃、10 min使蛋白变性，SDS- PAGE凝胶电泳，然后转移至0.45 μm的PVDF膜上，5% BSA封闭，一抗、二抗孵育，经ECL曝光成像。

1.2.7Transwell实验 Matrigel胶与DMEM培养基按1 ∶9混匀制成稀释液。小室滤膜均匀涂抹50 μl稀释液，37 ℃、5% CO2恒温箱滞留2 h。取3组培养24 h细胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液得下层细胞，DMEM重悬计数，细胞密度调为1×106个/ml。上室加细胞悬液各100 μl，下室加600 μl 20% FBS的DMEM培养液，37 ℃、5% CO2恒温箱孵育24 h，每组细胞设3个复孔。取出小室，吸出上室培养液，擦净上室表面Matrigel胶，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色20 min，晾干，拍照，200倍显微镜下计算穿膜细胞数。

1.2.8CCK8检测细胞增殖活性 待检测细胞计数，并铺于96孔板。确定细胞贴壁后，继续培养2～4 h使其贴壁紧密。96孔板每个孔加10 μl CCK8溶液，在培养箱孵育1 h，显色反应后，酶标仪测定450 nm处吸光度值(optical density，OD)，每组设5个复孔。根据OD450值绘制12 、24 、48 、72 h柱状图。

2 结果

2.1 组织和细胞中Nav1.5的表达临床收集的正常口腔黏膜组织和口腔鳞癌组织做免疫组化，光镜下观察组织中Nav1.5蛋白表达情况，癌组织中于细胞的胞膜和胞质中出现不同程度的棕黄深染，即Nav1.5蛋白呈阳性表达，在正常口腔黏膜组织中几乎看不到棕黄色，见图1。HSC- 3细胞中免疫荧光染色激光共聚焦镜下观察，在胞质和胞膜上可见荧光标记的Nav1.5呈红色，胞核呈蓝色，Nav1.5在HSC- 3细胞中阳性表达，见图2。

图1 免疫组化法检测Nav1.5蛋白的表达 ×100A：正常组织染色阴性；B：癌组织染色阳性

图2 免疫荧光法检测HSC- 3细胞中Nav1.5的表达 ×200

A：细胞核的染色呈蓝色；B：Nav1.5蛋白的染色呈红色； C：A和B的合成图

2.2 HSC- 3细胞Nav1.5的沉默效率FAM标记的siRNA转染HSC- 3细胞，镜下观察细胞，与明场视野下对比，转染效率较高。RT- PCR和Western blot 结果显示与CON组比较，S1、S2和S3组Nav1.5的mRNA表达均有所下调，S2和S3组下调较多，差异有统计学意义(P<0.01)。CON组和NC组之间差异无统计学意义，见图3。因此以下实验均采用S3转染。

2.3 Nav1.5对HSC- 3细胞增殖和侵袭的影响CCK8检测干扰后的细胞在450 nm处OD值，测量结果显示，在转染48 h后siRNA组(1.31±0.21)与CON组(1.06±0.22)和NC组(0.67±0.09)比较差异有统计学意义(F=9.006，P<0.01)，CON组和NC组之间差异无统计学意义，见图4。Transwell侵袭实验结果表明，siRNA组(7.33±1.55)与CON组(55.0±3.00)和NC组(47.0±4.00)比较，穿过小室细胞数明显减少，差异有统计学意义(F=222.7，P<0.001)，CON组和NC之间差异无统计学意义，见图5。

图3 经siRNA转染后Nav1.5沉默效率

A：转染FAM标记siRNA明场视野下；B：同一视野下荧光观察×200；C：转染后各组Nav1.5 mRNA相对表达水平；与CON组比较：**P<0.01；D：转然后各组Nav1.5蛋白表达水平；S1、S2和S3分别代表转染不同序列siRNA- Nav1.5

图4 经siRNA干扰后HSC- 3细胞OD450值比较

2.4 RT- PCR和Western blot检测转染siRNA- Nav1.5对相关蛋白表达的影响经siRNA- Nav1.5转染后的HSC- 3细胞内PCNA、MMP- 2和MMP- 9基因水平表达和蛋白水平表达均有所下降，差异有统计学意义(F=15.12、22.89、11.72，P<0.05)，见表3和图6、7。

3 讨论

口腔鳞状细胞癌作为颌面部最常见的恶性肿瘤，常常发生区域淋巴结转移，晚期可发生远处转移，严重威胁着人类的健康。为了克服传统手术加放化疗治疗方法的弊端，分子靶向治疗越来越重要。为了寻找更为有效的治疗靶点，在本课题组的早期研究中，刘伟佳 等[7]发现在口腔鳞状细胞癌中，Nav1.5的表达与正常组织相比显著提高，本研究免疫组化结果也得到证实。此外，Nav1.5的表达与组织分化程度和淋巴结转移有关，这提示着Nav1.5有望成为口腔鳞癌治疗的新靶点。

图5 经siRNA转染后HSC- 3细胞侵袭性比较 ×200

A：CON组；B：NC组；C：siRNA组; 与CON组比较：***P<0.001；与NC组比较：###P<0.001

表3 转染siRNA及空白组相关蛋白mRNA表达量

与CON组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 与NC组比较：#P<0.05，##P<0.01

近年来，越来越多的研究[8-11]发现Nav1.5与癌症密切相关，并表明Nav1.5在癌症增殖转移中发挥着重要作用。Mohammed et al[8]研究显示Nav1.5在高侵袭性乳腺癌细胞的胞质和核周区域以及板状伪足中表达。本研究免疫荧光共焦显微镜的结果显示HSC- 3细胞中也有着相同分布。为探讨Nav1.5对HSC- 3细胞增殖和侵袭能力的影响，本研究对HSC- 3细胞进行siRNA- Nav1.5干扰实验，RT- PCR和Western blot检测干扰后HSC- 3细胞中Nav1.5出现明显下调后再分别进行Transwell侵袭实验和CCK8检测干扰后细胞增殖OD值，实验结果显示经siRNA- Nav1.5干扰后的HSC- 3细胞的增殖和侵袭能力显著下降。说明Nav1.5在口腔鳞癌细胞生物学特性方面具有重要的调节作用。在乳腺癌的研究[9]中也有着相似的结果，沉默Nav1.5基因后，MDA- MB- 231细胞的侵袭能力显著降低。在结肠癌中，研究[10]表明Nav1.5基因涉及广泛的信号调节并参与肿瘤细胞侵袭的调节，是癌细胞侵袭的关键驱动因子。在动物体内研究[11]中，发现敲低Nav1.5显著抑制了肿瘤的生长和体内局部侵袭。尽管证明了Nav1.5在口腔鳞状细胞癌的生长和转移中起重要作用，但其具体机制尚不清楚。

PCNA与细胞的DNA合成密切相关，在细胞的增殖中起关键作用，也是细胞异常增殖的关键蛋白，有研究[12]表明，相比正常口腔组织在口腔鳞状细胞癌中PCNA过表达，提示其与口腔鳞癌的发生发展过程有关。在本实验中，RT- PCR和Western blot结果显示经siRNA- Nav1.5转染的HSC- 3细胞内PCNA表达下降。对肿瘤侵袭和转移机制的研究发现：细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解是肿瘤侵蚀正常组织并引发转移的重要途径。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMPs)是最重要的，可以降解ECM的所有成分，近年来已成为肿瘤侵袭和转移研究的热点，其中又以MMP- 2和MMP- 9最为重要。Chandolia et al[13]研究发现：相比正常口腔黏膜上皮，口腔鳞癌中MMP- 9表达水平显著提高。在本实验中，转染siRNA- Nav1.5 48 h后HSC- 3细胞内MMP- 2和MMP- 9表达均下调。以上结果说明口腔鳞癌中Nav1.5可能通过直接或间接地调控PCNA、MMP- 2和MMP- 9的表达进而影响着细胞生物学行为的改变。

图6 RT- PCR检测MMP- 2、MMP- 9和PCNA mRNA表达

A：MMP- 2 mRNA相对表达量； B：MMP- 9 mRNA相对表达量； C：PCNA mRNA相对表达量；与CON组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 与NC组比较：#P<0.05，##P<0.01

图7 Western blot检测干扰后HSC- 3细胞PCNA、MMP- 2和MMP- 9蛋白的表达变化

与CON组比较：*P<0.05； 与NC组比较：#P<0.05

为了进一步研究证明动物体内Nav1.5的生物学作用，下一步将进行裸鼠皮下造瘤后的进一步动物实验，从而推进Nav1.5作为临床口腔鳞癌治疗靶点的应用。