乐音子，王晓鹏，甄曙光，孙明明，吴本升，颜 帅，3

慢传输型便秘(slow transit constipation，STC)是指结肠传输功能障碍所致结肠通过时间延长导致的便秘[1]，该病是全球发病率较高的功能性结肠紊乱疾病，影响14%成人和36%的老年人[2]。便秘本身的危害性有一定局限性，但它能增加肾脏疾病、帕金森病和结肠癌等许多相关疾病的风险[3-4]。文献研究[5]表明超过30%的STC患者对目前许多防治便秘药物或保守的治疗方案无效。

通便汤是课题组通过对吴门医派明清时期吴门医家辨治便秘的医案进行数据挖掘后结合目前慢性便秘的病因形成的重组方[6-7]，前期临床研究证明通便汤可显著提升短链脂肪酸的含量，改善功能性便秘患者单次排便时间和间隔时间积分以及便秘患者生存质量量表评分[8]，尤其对泻药依赖性老年便秘患者临床疗效确切[9]。该研究采用盐酸洛哌丁胺混悬液灌胃法复制STC大鼠模型，以结肠c- kit和MLCK蛋白变化情况为着眼点，部分阐明通便汤治疗STC作用机制，为通便汤治疗STC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雄性健康Sprague Dawley大鼠60只，体质量(155±10)g，实验动物合格证号：SCXK-(沪)2013-0006，由上海杰思捷实验动物有限公司提供。饲养于南京中医药大学动物实验中心，许可证号：SYXK(苏)2014-0001。饲养条件为湿度(50±6)%，人工光照明暗各12 h，温度20～26 ℃。

1.2 实验药物、试剂与仪器盐酸洛哌丁胺胶囊(西安杨森制药有限公司)；枸橼酸莫沙必利胶囊(江苏恒瑞医药股份有限公司)；活性炭、水合氯醛(上海国药集团化学试剂有限公司)；c- kit兔抗鼠多克隆抗体、兔抗MLCK单克隆抗体(美国Sigma公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(上海赛默飞世尔科技公司)；DAB显色试剂盒等(苏州科贝生物技术有限公司)。

通便汤汤剂由肉苁蓉30 g，生白术30 g，槟榔15 g，瓜蒌皮15 g，紫苑12 g，杏仁12 g，枳实15 g，全当归15 g，生黄芪30 g，陈皮10 g，桔梗10 g，锁阳15 g。上述十二味药材均购自安徽省丰原铜陵中药饮片有限公司。通便汤水煎取浓缩汁，贮存于4 ℃冰箱中备用。FA100上皿电子天平(上海精科天平仪器厂)；866A 恒温鼓风干燥箱(上海浦东荣丰仪器公司)；CX22生物显微镜(日本奥林巴斯公司)；RM2235组织切片机(德国徕卡公司)；Tissue-Tek TEL组织包埋机(日本SAKURA公司)。

1.3 实验方法

1.3.1分组与造模 将60只雄性健康SD大鼠，随机分为正常组(10只)和建模组(50只)。正常组大鼠喂养普通干饲料，不限饮水。慢传输型便秘大鼠模型的建立：建模组50只大鼠，参照Jabri et al[10]用洛哌丁胺混悬液灌胃(西安杨森制药有限公司；国药准字H20051719，5 mg×24片)，给药剂量为3 mg/(kg·d)，每日给药2次，分别是9 ∶00和17 ∶00；连续14 d后，通过活性炭灌胃法，STC模型成功的标志：模型组大鼠粪便含水量和排便量明显少于造模前，确定STC大鼠模型复制成功后，随机分为模型组、通便汤低、中、高剂量组和莫沙必利组各10只。其中正常组和模型组均给予等体积的蒸馏水灌胃，通便汤给药剂量分别按照体表面积换算系数折算，通便汤低、中、高剂量组分别按照9.4、18.8、37.6 mg/kg分别灌胃，莫沙必利组悬浊液按照1.58 mg/kg灌胃，2次/d，连续14 d 。

1.3.2标本采集与处理 采集标本前，在末次给药禁食不禁水12 h，麻醉前1 h称重，水合氯醛麻醉开腹，10%活性炭混悬液2 ml灌胃，30 min后处死大鼠。取出大鼠全部肠段，计算活性炭混悬液小肠推进率。大鼠横结肠处取两份新鲜肠段组织，分别置入多聚甲醛固定液和-80 ℃冰箱中保存待测。

1.3.3粪便含水率情况 将各个时间段的大鼠粪便放入烤箱，150 ℃烘烤10 min。粪便含水率=(湿粪质量-干粪质量)/湿粪质量×100%。

1.3.4HE染色 HE染色后观察结肠肌层厚度和肠绒毛的高度。

1.3.5一氧化氮(NO)、一氧化氮酶(nitric oxide synthase, NOS)含量检测 采用ELISA法按照说明书操作检测液氮罐中结肠组织中NO和NOS含量。

1.3.6免疫组化法测定大鼠结肠组织中c- kit、MLCK蛋白表达情况 取大鼠结肠石蜡切片，免疫组化染色，高倍显微镜(×200)下观察结肠组织单位面积上c- kit、MLCK的阳性表达。

2 结果

2.1 通便汤对STC大鼠含水率的改善情况与正常组比较，模型组大鼠粪便含水率明显下降(P<0.05)。与模型组比较，通便汤各剂量组粪便含水率均明显升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠粪便含水率及肠道推进率比较

与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.2 通便汤对STC大鼠小肠推进率的改善情况由表1可知，与正常组比较，模型组大鼠肠道推进率下降明显(P<0.05)。与模型组比较，通便汤各剂量组和莫沙必利组肠道推进率有所上升，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组结肠病理切片情况由图1所示，正常组大鼠结肠黏膜完整，肠壁黏膜层、黏膜下层、肌层、外膜层四层组织结构清晰，柱状细胞和腺体排列整齐，未见炎症细胞聚集；模型组黏膜层间质血管扩张、充血；通便汤各剂量组与莫沙必利组肠黏膜腺体排列整齐，未观察到明显上皮损伤。从表2可以看出，与正常组相比，模型组大鼠结肠肌层厚度和肠绒毛的高度有显著差异(P<0.05)；经过通便汤和莫沙必利治疗后大鼠结肠肌层厚度和肠绒毛的高度均有所恢复，其中以通便汤高剂量组尤为明显(P<0.05)。

表2 各组大鼠结肠肌层厚度和肠绒毛的高度比较

与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.4 通便汤对STC大鼠结肠组织中肠神经递质NO和NOS的影响与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中NO和NOS含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠结肠组织NO和NOS含量明显降低(P<0.05)，其中通便汤低、中、高剂量组且呈剂量依赖性降低趋势，见图2、3。

图1 各组大鼠结肠病理学变化 ×200

图2 通便汤对STC大鼠结肠组织中NO的影响

与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.5 通便汤对STC大鼠结肠组织中c- kit和MLCK蛋白的影响由图4所示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中c- kit阳性细胞明显减少，分布较稀疏；通便汤低、中、高剂量组以及莫沙必利组结肠组织中c- kit阳性细胞表达呈不同程度增加，分布密集。与正常组比较，模型组大鼠c- kit阳性染色平均光密度值显著降低(P<0.01)；与模型组比较，通便汤低、中、高剂量组、莫沙必利组c- kit阳性染色平均光密度值显著升高(P<0.05)；与莫沙必利组比较，通便汤中、高剂量组c- kit蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)；表明通便汤可增加Cajal间质细胞的数量及改善其分布，见表3。由图5可知，各组大鼠结肠组织黏膜层、黏膜下层和肌层中可见平滑肌细胞胞质内棕黄色颗粒，颜色深浅与稠密程度不一的棕黄色颗粒。与正常组比较，模型组大鼠结肠肌层平滑肌细胞胞质染色呈浅黄色，MLCK蛋白光密度值显著降低(P<0.01)；与模型组比较，通便汤各剂量组、莫沙必利组MLCK蛋白光密度值显著升高(P<0.05)，见表3。

图3 通便汤对STC大鼠结肠组织中NOS的影响

图4 各组大鼠结肠组织c- kit蛋白表达 ×200

图5 各组大鼠结肠组织MLCK蛋白表达 ×200

表3 各组大鼠结肠组织中c- kit和MLCK光密度比较

与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05

3 讨论

STC发病机制复杂，治疗方法繁多，但疗效欠佳。Cajal间质细胞是胃肠起博细胞，是肠神经系统(enteric nervous system, ENS)控制胃肠平滑肌运动的中介，参与胃肠道神经递质的信号传导[11]。c- kit基因是Cajal细胞的特异性标志物，有研究[12]显示，STC大鼠c- kit的表达在升结肠和降结肠均低于对照组，进一步证明结肠内Cajal细胞数目减少参与STC发病过程。结肠组织ICC数量减少及其结构破坏，导致平滑肌收缩运动失常从而出现结肠动力障碍[13]。除此之外，研究[14]表明平滑肌收缩对于胃肠动力的变化具有重要的调控作用，其收缩性下降会导致肠蠕动下降，进而诱发便秘发生。MLCK是平滑肌收缩的核心蛋白，当平滑肌细胞收到刺激，胞内钙离子浓度陡然升高，并与CaM结合Ca2+形成复合物，使肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化，导致平滑肌细胞产生收缩[15]。再者，信使分子NO作为ENS中重要抑制性神经递质，参与调节肠道动力；NO主要由NOS合成，NOS通过催化L-精氨酸生成NO，NOS活性变化影响NO的生成量；NO激活可溶性鸟苷酸环化酶，cGMP浓度升高，引起结肠蠕动减弱[16]。

前期研究[17]证实通便汤通过改善肠道菌群提高老年性慢传输型便秘患者临床疗效确切，此外，通便汤还能明显降低STC大鼠结肠肌电时频率和振幅变异系数，稳定结肠慢波节律。因此本研究拟从肠神经递质、结肠Cajal细胞和平滑肌肌源性角度观察通便汤对STC大鼠结肠Cajal细胞和平滑肌细胞MLCK蛋白的影响。结果显示，与模型组大鼠比较，通便汤各剂量组可显著提高STC大鼠粪便含水率及肠道推进率(P<0.05)，同时升高c- kit和MLCK蛋白表达量及降低结肠组织NO和NOS的水平(P<0.05)，从而防治STC。本研究还观察到通便汤可增加STC大鼠结肠肌层厚度，恢复肠绒毛的高度；肠绒毛的高度与肠吸收面积成正比，通便汤改善肠道菌群与此是否有关值得进一步的实验验证。

本项研究仍有许多待完善之处：通便汤是临床中药复方制剂，因经费等客观原因暂时未明确本方的有效物质基础；且对STC大鼠结肠组织中Cajal细胞仅仅进行初步的观察和探讨。下一步课题组将采用液相色谱-质谱联用技术明确通便汤有效成分；结合网络药理学分析技术对通便汤多成分、多靶点、多通路的相互作用规律和调控网络进行挖掘和分析，以期为后续深入研究通便汤调控ICC网络改善STC作用机制和发展新的有价值的药物奠定基础。