朱小长，陶连元，杜瀛瀛，时 云

胰腺癌(pancreatic carcer，PC)是一种常见的消化道肿瘤，其恶化程度高、病程短，具有早期不易确诊、手术治愈率低、5年生存率不足1%的特点，是预后效果最差的恶性肿瘤之一[1]。目前PC的化疗方案主要以铂类药物为基础，顺铂(cis- dichlorodiamine platinum，DDP)是代表药物之一。DDP属于细胞周期非特异性抗肿瘤药物，与PC肿瘤细胞的DNA结合并抑制其复制转录，促进肿瘤细胞凋亡[2]。大量研究[3]表明PC细胞已经对DDP产生耐药性，雷帕霉素哺乳动物靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路改变是原因之一。雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是一种新型高效低毒的大环内酯类免疫抑制剂，能抑制mTOR信号通路，减缓肿瘤细胞对DDP的耐药性[4]。该研究选取3种PC细胞株，旨在进一步研究RAPA通过mTOR信号通路抑制PC肿瘤细胞作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂PANC- 1细胞、BxPC- 3细胞、SW1990细胞购自中国北京细胞系资源库；RAPA购自海门市碧云天生物技术研究所；DDP、四甲基偶氮唑盐(methylthio tetrazole，MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；迁移(Transwell)小室、抗磷脂酰肌醇3- 激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3K)、磷酸化磷酯酰肌醇- 3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol- 3- kinase，p- PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p- AKT)、mTOR、磷酸化雷帕霉素哺乳动物靶点(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p- mTOR)、β- actin、羊抗兔Ig二抗等抗体、胰蛋白酶、青霉素链霉素双抗均购自美国赛默飞世尔科技公司；RPMI- 1640、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。

1.2 实验方法用含10%的胎牛血清的达尔伯克必需培养基(dulbecco minimum essential medium，DMEM)(PANC- 1)或RPMI- 1640(BxPC- 3、SW1990)于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2.1划痕修复方法 3种细胞接种于6孔板，待细胞融合度80%，划痕、拍照，去除培养基，加2.5%血清培养基，用含20 mg/L DDP或20 mg/L DDP+10 μmol/L RAPA的血清培养基，培养24 h拍照。划痕修复率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.2.2Transwell方法 用胰蛋白酶消化细胞，去除培养液，磷酸盐缓冲液清洗2次，加无血清培养基调整细胞密度至15×104个/ml，上室接种200 μl细胞液，下室加600 μl 10%的胎牛血清，用20 mg/L DDP或20 mg/L DDP+10 μmol/L RAPA处理细胞12 h，甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下观察并计算穿膜细胞数。

1.2.3MTT方法 胰蛋白酶消化细胞，接种于96孔板，每孔5×103个细胞，孵育12 h，细胞贴壁后吸去培养基，加入DDP及0、5、10、20 μmol/L RAPA血清培养基200 μl，每24 h换液1次，48 h后加入MTT 20 μl，培养4 h，去除培养基加入DMSO 150 μl，避光摇10 min，取100 μl，490 nm检测光密度(optical density，OD)值，计算DDP对细胞株的半抑制浓度(50% inhibiting concentration，IC50)。每组6孔，重复3次，取平均值。

1.2.4Western blot方法 取总蛋白，上样10 μg，SDS- PAGE分离蛋白，转印PVDF，牛血清白蛋白封闭1 h，加一抗，4 ℃过夜，TBST洗涤3次，加二抗孵育2 h，加ECL发光液，拍照，分析条带灰度。

2 结果

2.1 RAPA抑制胰腺癌细胞株迁移能力划痕实验显示，单用DDP 时，PANC- 1、BxPC- 3、SW1990三种耐DDP细胞株均具有较强的迁移能力，PANC- 1的迁移能力最强，其次为SW1990、BxPC- 3。联合RAPA，3株耐药株的迁移能力均显著低于未加RAPA(P<0.01)，见表1、图1。

表1 RAPA抑制胰腺癌细胞株迁移能力

2.2 RAPA抑制胰腺癌细胞株侵袭能力Transwell实验显示：单用DDP，PANC- 1、BxPC- 3、SW1990三种耐DDP细胞株均具有较强的侵袭能力，联合RAPA，3株耐药株的侵袭能力显著降低(P<0.01)，见表2、图2。

表2 RAPA抑制胰腺癌细胞株侵袭能力

2.3 RAPA降低胰腺癌细胞株IC50划痕修复实验及Transwell实验显示:10 μmol/L RAPA能抑制PANC- 1、BxPC- 3、SW1990耐药株的迁移能力和侵袭能力，故进一步设计DDP联合不同浓度梯度的RAPA，考察DDP对3种细胞株的IC50的变化。结果显示：未加RAPA时，3株细胞株的IC50较高，加入5、10、20 μmol/L RAPA，3株细胞株的IC50显著降低(P<0.01)，见表3。

2.4 RAPA抑制PANC- 1细胞株PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表达Western blot实验显示：单用DDP时，PANC- 1耐药株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表达量较高，联合加入5、10、20 μmol/L RAPA后，PANC- 1耐药株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表达量显著降低(P<0.01)，见图3。

图1 划痕修复实验结果 ×40

图2 Transwell实验结果 ×100

组别DDPDDP+RAPA(5 μmol/L)DDP+RAPA(10 μmol/L)DDP+RAPA(20 μmol/L)t值P值PANC-142.31±4.6834.59±4.22∗∗23.38±4.24∗∗##13.78±3.11∗∗##ΔΔ55.90<0.01BxPC-337.58±4.2430.24±3.52∗∗18.34±4.01∗∗##10.36±3.24∗∗##ΔΔ62.01<0.01SW199033.69±3.5727.21±3.28∗∗18.34±3.21∗∗##12.24±3.14∗∗##ΔΔ49.36<0.01

与对照组比较：**P<0.01；与低剂量组比较：##P<0.01；与中剂量组比较：ΔΔP<0.01

图3 RAPA对 PANC- 1 细胞蛋白表达的影响

A:DDP;B:DDP+RAPA(5 μmol/L);C:DDP+RAPA(10 μmol/L);D:DDP+RAPA(20 μmol/L)；与DDP组比较：**P<0.01；与DDP+RAPA (5 μmol/L)组比较：##P<0.01；与DDP+RAPA(10 μmol/L)组比较：ΔΔP<0.01

2.5 RAPA抑制BxPC- 3细胞株PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表达Western blot实验结果显示：仅加入20 mg/L DDP 时，BxPC- 3耐药株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表达量较高，联合加入5、10、20 μmol/LRAPA后，BxPC- 3耐药株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表达量显著降低(P<0.01)，见图4。

2.6 RAPA抑制SW1990细胞株PI3K/AKT/mTOR通路的蛋白表达Western blot实验显示：仅加入20 mg/L DDP 时，SW1990耐药株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、mTOR、p- mTOR蛋白表达量较高，联合加入5、10、20 μmol/L RAPA，SW1990耐药株的mTOR蛋白表达量降低，三组间差异无统计学意义(P>0.05)；SW1990耐药株的PI3K、p- PI3K、AKT、p- AKT、p- mTOR蛋白表达量显著降低(P<0.01)，见图5。

3 讨论

研究[5]表明，肿瘤细胞的化药耐药是导致化疗失败的重要原因，根据耐药性产生的机制，可分为原发性耐药(primary drug resistance，PDR)和多药耐药(multidrug resistance，MDR)，PDR 仅对诱导药物产生耐药，MDR不仅对诱导药物产生耐药，还对结构不同、作用机制不同的药物产生耐药，是肿瘤化疗失败的首要原因，抑制多药耐药蛋白，能增加DDP 对耐药基因DNA的损伤。细胞产生耐药性的机制最主要有：① 细胞内药物浓度下降：肿瘤细胞膜改变使药物不易进入细胞内，或肿瘤细胞增加药物外排，最终使细胞内药物浓度下降，不能达到最低有效浓度[6]；② 肿瘤细胞凋亡程序改变，例如，肿瘤细胞损伤激活细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路，增强肿瘤细胞DNA损伤修复机制，改变信号通路相关基因活性[7-8]。

图4 RAPA对 BxPC- 3 细胞蛋白表达的影响

A：DDP组；B：DDP+RAPA (5 μmol/L)；C：DDP+RAPA(10 μmol/L)；D：DDP+RAPA (20 μmol/L)；与DDP组比较：**P<0.01；与DDP+RAPA (5 μmol/L)组比较：##P<0.01；与DDP+RAPA(10 μmol/L)组比较：ΔΔP<0.01

mTOR信号通路主要由PI3K、AKT、mTOR等组成，影响细胞增殖、凋亡、代谢等生理活动。胰岛素样生长因子作用，激活PI3K，使磷脂酰肌醇4,5- 二磷酸(phosphatidylinositol 4,5- diphosphate，PIP2)磷酸化生成PIP3，PIP3促使AKT在细胞膜表面被脯氨酸依赖性激酶磷酸化形成p- AKT，使处于抑制状态的mTOR被激活。磷酸化的p- mTOR激活下游相关分子，促进细胞翻译、合成，调节细胞代谢等生理功能[9]。有研究[10]证实mTOR信号通路可以影响肿瘤细胞的生长代谢、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞的侵袭能力。有学者从DDP 耐药肺癌细胞株A549/顺二氨基二氯铂中发现AKT1呈高表达，抑制AKT1表达可以逆转肺癌细胞对DDP 的耐药[11]。Wang et al[12]和Zhang et al[13]研究表明，CA916798基因编码的蛋白存在于mTOR信号通路的3个磷酸化位点，mTOR通路可在转录水平上调控该基因的表达，诱导DDP耐药。

图5 RAPA对SW1990细胞蛋白表达的影响

A：DDP组；B：DDP+RAPA (5 μmol/L)；C：DDP+RAPA(10 μmol/L)；D：DDP+RAPA (20 μmol/L)；与DDP组比较：**P<0.01；与DDP+RAPA (5 μmol/L)组比较：##P<0.01；与DDP+RAPA(10 μmol/L)组比较：ΔΔP<0.01

本研究显示：PANC- 1、BxPC- 3、SW1990 3种PC细胞株均对DDP耐药，单用DDP时，3种细胞株均具有很强的细胞迁移能力和侵袭能力，IC50较高；联用RAPA后，3种细胞株的迁移能力和侵袭能力显著下降(P<0.01)，这与朱方 等[14]的研究结果一致。当加入不同浓度的RAPA后，3种细胞株的生存率均明显降低，其IC50显著下降(P<0.01)，这提示RAPA可以增强耐药株对DDP的敏感性。进一步的Western blot 实验检测显示：RAPA可下调PANC- 1及BxPC- 3细胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达，抑制PI3K、AKT、mTOR磷酸化，虽然对SW1990的mTOR表达的影响较弱，但仍可显著抑制相关蛋白磷酸化，表明RAPA可能是通过抑制mTOR通路逆转PC细胞株DDP 耐药机制。mTOR有mTORC1和mTORC2两种复合体，均对肿瘤细胞的增殖、分化、生长、转移等有不同的效应。蔡鹏涛 等[15]研究表明，mTORC2在耐药细胞中的表达明显高于敏感株，mTORC1在敏感细胞中的活性更高，但是在两种细胞中，mTOR信号通路均处于高度活化状态，提示mTORC1和mTORC2之间可能存在动态平衡，当上游信号发生改变时，将使mTORC1向mTORC2转化，产生耐药性，这也可能是本研究中RAPA对SW1990耐药株的mTOR蛋白抑制不明显的原因，表明可能还存在其他通路影响mTOR蛋白的表达，其对DDP 产生耐药的具体机制还值得进一步研究。