顾亚男，周 宏，朱婷婷，李名聪，罗 欣，张胜权

甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)代谢途径是细胞生长过程中重要的代谢途径，其中间产物与终产物包括MVA、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate， GGPP)和胆固醇(cholesterol,CH)等[1]。此代谢途径产生的FPP和GGPP可以为小G蛋白的脂化过程提供异戊烯基，从而参与蛋白活化过程，以此来影响细胞代谢途径(尤其是对Ras超家族)[2]；此外，CH是细胞内膜的组成成分，也可转化成生物活性物质[3-4]。研究[5]表明，MVA代谢途径中的代谢产物会影响细胞的增殖、分化与凋亡。

MVA代谢途径中一些酶的特异性抑制剂，如：3- 羟基3- 甲基戊二酸辅酶A(3- Hydroxy- 3- Methylglutary CoA，HMGCoA)还原酶抑制剂、他汀类及胺丁羟磷酸盐(alendronate, ALD)等能通过改变细胞周期相关蛋白的表达来对皮肤角质形成细胞(keratinocytes，KCs)增殖产生抑制作用[6]。此外，当编码MVA途径的基因纯合突变时，由于突变位点的不同从而酶活性缺失程度不同[7]。2012年Zhang et al[8]研究表明甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase, MVK)的杂合突变可导致播散型浅表性汗孔角化症。以上表明了MVA途径对皮肤的生长发育产生的重要影响，但对皮肤影响的可能机制尚不明确。因此，该实验通过对KCs添加一种法尼基合成酶的抑制剂ALD来探讨其对KCs增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂KCs细胞是由外科手术所得皮肤经分离获得；M154CF 培养基、胶原涂层基质、中性蛋白酶、胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司；青霉素链霉素溶液、RIPA裂解液及细胞周期试剂盒购自上海碧云天生物公司；细胞活力测定实验(MTS)试剂盒及抑制剂ALD、MVA、CH、FPP、 GGPP均购自美国sigma公司；细胞周期蛋白B1 (cell cycle protein B1, Cyclin B1)、Cyclin E及β- actin购自美国abcam公司；细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂(cyclin- dependent protein kinase inhibitor, P21)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, pAKT)、磷酸化的胞外信号调节激酶1/2( phosphorylated extracellular signal- regulated kinase 1/2, pERK1/2)均购自美国Santa Cruz公司；所用二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 外科手术获得无菌新鲜皮肤组织，无血清的培养基清洗数次以去除表面细菌。用已消过毒的镊子和剪刀将皮肤组织剪成数个小块，继续用无血清的培养基冲洗多次后，放置于装有无菌0.4%中性蛋白酶的离心管中，4 ℃消化过夜。第2天取出消化完全的皮肤组织，无菌镊子撕下表皮，加入0.025%的胰蛋白酶消化3～5 min，然后置于200目细胞筛上，用无菌注射器钝头研磨，并用无菌无血清的培养基冲洗数次，将所得液体离心，用M154缓慢吹打形成KCs悬液，按一定比例接种于细胞培养瓶中，在37 ℃、5% CO2恒温恒湿细胞培养箱内培养。本实验中所用药物浓度为ALD 100 μmol/L、MVA 200 μmol/L、 CH 40 μmol/L、 FPP 5 μmol/L、 GGPP 1 μmol/L。

1.2.2细胞活力测定实验(MTS) 0.025%胰酶消化收集KCs细胞接种于已铺有胶原涂层的96孔板中，细胞悬液浓度调整为6×104/ml，每孔100 μl，待细胞达到一定覆盖率时(70%～80%)，按以下处理方式：ALD、ALD+MVA、ALD+CH、MVA、CH、ALD+FPP、ALD+GGPP、FPP、GGPP加入相应药物(药物浓度参见1.2.1细胞培养)；并设置空白对照组。继续培养2 d后，每孔加20 μl MTS试剂后，混匀，在细胞培养箱里孵育2～4 h后使用酶标仪检测其490 nm处的吸光度(optical delnsity,OD)值，实验重复3次。

1.2.3细胞周期检测 0.025%胰酶消化收集KC细胞接种于已铺有胶原涂层的6孔板中，每孔细胞数为5×104，在孵箱内培养，待细胞密度达到70%～80%时，分为药物单独作用组(药物浓度参见1.2.1细胞培养)：ALD、MVA、CH、FPP、GGPP；联合作用组：ALD+MVA、ALD+CH、ALD+FPP、ALD+GGPP；并设置空白对照组作用2 d后，用0.025%胰酶消化后收集KCs细胞，按照细胞周期试剂盒的说明书操作后，室温下避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期，Flowjo软件分析细胞周期，实验重复3次。

1.2.4Western blot检测蛋白P21、Cyclin B1和Cyclin E的表达 用0.025%胰酶消化收集KCs细胞接种于已铺有胶原涂层的24孔板中，每孔细胞数为2×105，待细胞达到70%～80%汇合度时，分为药物单独作用组(药物浓度参见1.2.1细胞培养)：ALD、MVA、CH、FPP、GGPP；联合作用组：ALD+MVA、ALD+CH、ALD+FPP、ALD+GGPP；并设置空白对照组作用2 d后，提取细胞总蛋白，进行SDS- PAGE凝胶电泳，按10 μl/孔上样量加入适当浓度的胶中，然后进行电泳(浓缩胶60 V，40 min；分离胶120 V，1 h)、转移(恒流300 mA，1.5 h)、封闭(5%脱脂牛奶封闭2 h)、孵育一抗(4 ℃，过夜)、孵育二抗(常温摇床孵育2 h)，洗膜后用Thermo SuperSignal West Pico Trial Kit化学发光底物显影，分析各蛋白的表达。

2 结果

2.1 CH能部分补救ALD对KCs增殖抑制效应ALD(100 μmol/L)单独处理KCs细胞时，其显著抑制KCs的增殖，抑制率为50%，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；当给ALD分别补充MVA、CH、FPP、GGPP时，仅CH有部分补救ALD对KCs增殖抑制的影响，与只加ALD组比较差异有统计学意义(P<0.01)；而MVA可协同ALD对KCs增殖的抑制效应。见图1。

图1 ALD单独或联合MVA、CH、FPP、GGPP对KCs增殖抑制作用

2.2 CH能调节ALD对KCs细胞周期G1期的阻滞效应ALD单独作用于KCs时，可造成细胞G1期阻滞；当补充MVA、CH、FPP、GGPP进行处理时，仅CH能够部分补救ALD引起的G1期阻滞，FPP、GGPP单独处理KCs时均能造成细胞G1期阻滞，并且FPP能协同ALD的G1期阻滞，与只加ALD组相比差异有统计学意义(F=55.913，P<0.05)。见图2。

2.3 ALD单独或联合MVA、CH、FPP、GGPP处理KCs对Cyclin B1、Cyclin E和P21表达的影响ALD单独处理KCs后，与空白对照组比较，ALD显著下调Cyclin B1、上调P21、Cyclin E的表达(P<0.01)；联合补充MVA、CH后，均能协同ALD，从而上调P21的表达[ALD与MVA交互作用(F=45.105，P<0.01)，ALD与CH交互作用(F=106.525，P<0.01)]，拮抗ALD对Cyclin B1的下调[ALD与MVA交互作用(F=352.476，P<0.01)]，ALD与CH交互作用(F=163.661，P<0.01)，拮抗ALD下调Cyclin E的表达[ALD与MVA交互作用(F=34.896，P<0.01)，ALD与CH交互作用(F=64.070，P<0.01)]，与ALD组比较，差异均有统计学意义，见图3A、3B。联合补充FPP后，可协同ALD下调Cyclin B1的表达[ALD与FPP交互作用(F=23.924，P<0.01)]，拮抗ALD上调Cyclin E[ALD与FPP交互作用(F=8.930，P<0.01)]，P21的表达[ALD与FPP交互作用(F=62.505，P<0.01)]，与ALD组相比，均有统计学意义；当补充GGPP时，能协同ALD上调Cyclin E的表达[ALD与GGPP交互作用(F=6.291，P<0.01)]，与ALD组比较，差异均有统计学意义。见图3C、3D。

图2 流式细胞术检测细胞周期

A：ALD单独或联合MVA、FPP对KCs细胞周期的影响；B：ALD单独或联合GGPP、CH对KCs细胞周期的影响；与空白对照组比较：**P<0.01；与只加ALD组比较：##P<0.01

图3 ALD单独或联合用药对KCs细胞周期蛋白表达的影响

A：ALD单独或联合MVA、CH对KCs细胞周期蛋白的影响；C：ALD单独或联合FPP、GGPP对KCs细胞周期蛋白的影响；B、D：蛋白表达的灰度分析；与空白对照组比较：**P<0.01；与只加ALD组比较：##P<0.01

图4 ALD单独或联合用药对KCs信号途径相关蛋白表达的影响

A：ALD单独或联合MVA、CH对KCs 信号途径相关蛋白的影响；C：ALD单独或联合FPP、GGPP对KCs信号途径相关蛋白的影响；B、D：蛋白表达的灰度分析；与空白对照组比较：**P<0.01；与只加ALD组比较：##P<0.01

2.4 ALD单独或联合MVA、CH、FPP、GGPP处理KCs对PERK1/2、PAKT表达的影响ALD单独处理KCs时，显著上调PAKT的表达量(F=33.564，P<0.01)，下调PERK1/2的表达(F=394.753，P<0.01)，与空白对照比较差异有统计学意义；当给ALD处理组联合补充MVA、CH、FPP、GGPP时，MVA可拮抗ALD的PERK1/2下调，与ALD组比较，差异均有统计学意义[ALD与MVA交互作用(F=32.413，P<0.01)]，见图4A、4B。而CH、FPP、GGPP均拮抗PAKT的上调[ALD与CH交互作用(F=95.622，P<0.01)；ALD与FPP交互作用(F=136.283，P<0.01)；ALD与GGPP交互作用(F=699.076，P<0.01)]及PERK1/2的下调[ALD与CH交互作用(F=47.359，P<0.01)；ALD与FPP交互作用(F=139.892，P<0.01)；ALD与GGPP交互作用(F=284.511，P<0.01)]，与ALD组比较，差异均有统计学意义。ALD与MVA、CH单独或联合补充对PAKT、PERK1/2表达的影响见图4A、4B；ALD与FPP、GGPP单独或联合补充对PAKT、PERK1/2表达的影响见图4C、4D。

3 讨论

皮肤是由表皮构成的机体最重要的器官之一，表皮是由皮肤KCs组成的，皮肤KCs能够阻止皮肤的水分流失及保护皮肤不受体外细菌等微生物的侵袭。MVA途径对机体来说是非常重要的一条代谢途径，能够对细胞起到非常重要的作用，其代谢中间产物及终产物等可影响到细胞的增殖、分化与凋亡等[9]。

研究[10]表明ALD能损害上皮细胞的黏附，抑制人口腔黏膜细胞的分化与增殖。本研究中，ALD抑制 KCs的增殖，有可能是由于ALD对法尼基合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FDPS)的抑制，从而使上游产物MVA积累，下游产物FPP、GGPP、CH缺失；一般来说，上游产物MVA的积累有可能导致细胞MVA中毒，从而加强ALD对KCs的抑制，而下游产物FPP、GGPP的补充应当会减弱ALD的抑制，然而，补充下游产物FPP、GGPP，协同作用了ALD对KCs的抑制；仅CH减弱了ALD的抑制作用。ALD明显降低Cyclin B1的表达，且不同程度上增强了Cyclin E、P21的表达，而CH可上调P21，拮抗ALD对Cyclin B1和Cyclin E的表达。研究[11-12]表明高表达的Cyclin E会出现在G1期，而Cyclin B1调控细胞从G2到M期，P21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，抑制细胞周期从G1期到S期，从而使其阻滞在G1期。因此，CH通过拮抗ALD对 Cyclin B1的表达，从而减弱ALD对细胞周期的阻滞作用。除此之外，本研究还探讨了丝裂原激活蛋白激酶(mitogen- activated protein kinases，MAPK)及磷脂酰基酶3- 激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3- kinase- protein kinase B，PI3K- AKT)代谢途径对KCs细胞增殖产生的影响，以上两种代谢途径对KCs增殖的影响很复杂，表明了KCs的增殖不仅与以上两条代谢途径相关，更是多种代谢途径共同作用的复杂结果，有待继续探讨。

综上，ALD抑制KCs增殖，CH可部分减弱ALD对KCs增殖的抑制作用。结果表明CH的缺失有可能会形成某些与MVA代谢途径相关的皮肤方面的疾病，同样，CH也为某些MVA代谢途径相关的皮肤方面的疾病提供了治疗的新思路。然而，本实验仅局限于体外细胞研究，下一步可以此为基础，构建MVA代谢途径相关基因的小鼠模型，从体外转移到体内来研究MVA代谢途径紊乱对皮肤表型的影响及其相关分子机制的研究。