秦祖兴 唐永梅 牟联俊 徐丽湘 梁明明 罗婷 李楠 李忻琳

【关键词】 囊胚培养;微滴培养;异常受精胚胎

Optimization of blastocyst culture using ≥ 3PN embryos in IVF/ICSI cycle Qin Zuxing， Tang Yongmei，

Mu Lianjun， Xu Lixiang， Liang Mingming， Luo Ting， Li Nan， Li Xinlin. Reproductive Center， Liuzhou Maternal and Child Health Care Hospital， Liuzhou 545001， China

Corresponding author， Li Xinlin

【Abstract】 Objective To investigate the effect of the number of embryos cultured in a single blastocyst medium droplet and the volume of blastocyst medium droplet on blastocyst formation.  Methods   With the informed consents of the patients， the abnormally fertilized embryos （   ≥3PN embryos） with pronuclear number ≥ 3 from July 2016 to June 2018 were utilized for blastocyst culture. The inclusion criteria were cell number ≥ 6 and fragment ≤ 30%. The 3PN embryos on the 3rd day of insemination were randomly divided into one， two， three， and four combinations and cultured in a single blastocyst medium droplet in a volume of 30 μl. Subsequently， the 3PN embryos on the 3rd day of insemination were randomly cultured in 10 μl， 20 μl， 30 μl， 40 μl， and 50 μl of blastocyst medium droplet. The formation rate of blastocysts was observed and statistically compared.  Results The number of embryos did not affect the formation rate of≥stage 3 or early blastocysts （both P > 0.05）. The difference was not statistically significant in the formation rates of ≥stage 3 blastocysts and ≥early blastocysts in groups of different volume of culture droplets （both P > 0.05）.  Conclusion The number of embryos cultured in a single blastocyst medium droplet and the volume of culture droplets exerts no effect on the blastocyst formation.

【Key words】 Blastocyst culture;Microdroplet culture;Abnormally fertilized embryo

辅助生殖技术中，囊胚移植在第5 ～ 6日进行，较卵裂胚移植晚2 ～ 3 d。相比卵裂胚移植，囊胚移植可以提高临床妊娠率、种植率、继续妊娠率，降低早期流产，还可以提高活产率[1-2]。体外培养条件下囊胚形成率和囊胚质量是囊胚移植的关键。在助孕过程中常能见到一定数量的多原核（≥3PN）异常受精胚胎。临床工作中，≥3PN胚胎属于不可用胚胎，通常是废弃处理。将≥3PN胚胎应用于科研，伦理方面更易被接受。同时，≥3PN胚胎也具有一定潜能，经体外培养可发育至囊胚阶段。本研究尝试将≥3PN胚胎用于囊胚培养方案的优化，探讨单个囊胚培养滴中培养的胚胎数目和囊胚培養滴体积对囊胚形成的影响，为今后的临床工作提供参考。

材料与方法

一、材 料

2016年7月至2018年6月在我中心使用辅助生殖技术助孕患者的≥3PN胚胎中，选择细胞数≥6、碎片≤30%者，在患者了解研究方案并签署知情同意书后用于研究。本研究方案经医院医学伦理委员会批准。

二、方 法

1. 胚胎培养数目对囊胚形成的影响

授精第3日的≥3PN胚胎随机分为1、2、3、4个的组合分别置于体积为30 μl的单个囊胚培养液滴中培养，观察囊胚培养情况。按Gardner系统进行囊胚评级。卵裂期培养液为卵裂培养基（COOK， 澳大利亚）或G-1（Vitrolife， 瑞典），囊胚培养液为相对应的Blastocyst Medium （BM，COOK， 澳大利亚）或G-2（Vitrolife， 瑞典）。本研究采用COOK桌面三气培养箱（型号：K-MINC-1000）培养胚胎。培养条件为37℃、6% CO2、5%O2。

2. 囊胚培养滴体积对囊胚形成的影响

本试验将授精第3日的≥3PN胚胎随机置于体积为10、20、30、40、50 μl的囊胚培养滴中培养，观察囊胚培养情况。按Gardner系统进行囊胚评级。卵裂期培养液、囊胚培养液、培养箱同前一致。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0处理数据。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、胚胎培养数目对囊胚形成的影响

不同胚胎数目组的胚胎培养方式比较差异无统计学意义（P > 0.05）。不同胚胎数目组间的3期以上囊胚或早期以上囊胚的形成率比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），见表1。

二、囊胚培养滴体积对囊胚形成的影响

不同囊胚培养滴体积组的胚胎培养方式相近（P > 0.05）。不同囊胚培养滴体积组间的3期以上囊胚和早期以上囊胚形成率比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），见表2。

讨 论

囊胚培养常采用微滴法聚集培养，即将发育水平相近的胚胎置于同一个培养滴中共同培养。其原理是将胚胎聚集在一个较小的区域（10 ～ 50 μl）以达到充分利用自分泌和旁分泌效应的目的。

囊胚的形成和质量受多种因素影响。郑炜炜等[3]认为，不同精子来源和授精方式的胚胎发育成囊胚的潜能是不同的。鲁振宇等[4]认为，第3日胚胎的细胞数、质量与囊胚形成率呈正相关。任新玲等[5]也認为，卵裂迟缓胚胎的囊胚形成率、优质囊胚率均低于卵裂速度正常的优质胚胎。此外，刁英等[6]报道有早期分裂受精卵移植的临床妊娠率高于无早期分裂受精卵移植，早期分裂受精卵可作为胚胎移植选择受精卵的指标之一。因此，有早期分裂的受精卵囊胚形成率是否更高也是今后可以探讨的方向。本研究选择≥3PN胚胎作为研究对象，探讨胚胎数目和培养滴体积对囊胚形成的影响。为避免胚胎发育速度不同步或胚胎质量低下影响研究结果，本研究设定入组标准为细胞数≥6、碎片≤30%。

Tao等[7]将人胚胎按相同级别以2 ～ 5个分组进行囊胚培养，与随机分组相比，囊胚形成率和胚胎利用率得到提高，认为可能是与好胚胎分泌的有益因子或去除来自劣质胚胎分泌的有害因子有关。Sun等[8]将人废弃胚胎按1 ～ 4个分组在30 μl微滴中聚集培养，结果显示聚集培养可以在一定程度上提高囊胚率和囊胚质量，他们认为3个胚胎的群组培养是比较好的选择。本研究显示，胚胎数目不影响囊胚形成率，与既往研究不一致的原因可能是胚胎培养系统有一定差异，或者≥3PN胚胎来源对发育结果存在一定的影响。

Minasi等[9]将人胚胎置于7 μl 培养滴中培养的囊胚形成率高于35 μl培养液滴，认为胚胎自分泌因子对囊胚发育具有促进作用。相反，De Munck等[10]将单个人类胚胎置于25 μl 或 7 μl 微滴中培养，发现减少培养滴体积（7 μl）对早期胚胎发育有负面作用：减少了第3日胚胎细胞数，降低了囊胚形成率和囊胚质量。本研究显示，囊胚培养滴体积对囊胚形成无影响。

与微滴法相似的还有微穴法，即在培养皿底部做出数个小穴，以微滴覆盖，将胚胎置于小穴中培养。微穴法为单个或小群胚胎提供了较小的培养微环境，使它们可以共享更大体积的培养液， 并且可以避免微滴易移位或融合等缺点。由于相同的技术原理，微穴法相关研究可以作为微滴法的参考。Dai等[11]用微穴法进行鼠胚培养，结果表明聚集培养的囊胚形成率优于单个胚胎培养，但微穴法培养不能改善单个胚胎培养时较差的发育率。

本研究将≥3PN胚胎作为研究对象，结果显示胚胎培养数目不影响囊胚形成，培养滴体积对囊胚形成无明显影响。

参 考 文 献

[1] Wang SS， Sun HX. Blastocyst transfer ameliorates live birth rate compared with cleavage-stage embryos transfer in fresh in vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection cycles： reviews and meta-analysis.Yonsei Med J，2014，55（3）：815-825.

[2] Oron G， Sokal-Arnon T， Son WY， Demirtas E， Buckett W， Zeadna A， Holzer H， Tulandi T. Extended embryo culture is not associated with increased adverse obstetric or perinatal outcome. Am J Obstet Gynecol，2014，211（2）：165.e1-e7.

[3] 郑炜炜，谭玉梅，祝晓丽，陈瑞玲，谭颖，姜荣华，刘善文，吴铮，宋革. 不同精子来源及授精方式对剩余胚胎继续囊胚培养结局的影响. 生殖与避孕， 2016， 36（10）： 845-851.

[4] 鲁振宇，张云山，糜若然. 胚胎发育对囊胚形成的影响.天津医药杂志，2010，38（4）：257-259.

[5] 任新玲，刘群，艾继辉，章汉旺. 胚胎卵裂速度异常对囊胚形成的影响.中国妇幼保健，2012，27（7）： 1061-1063.

[6] 刁英，杨智敏，谭兵兵. 移植早期分裂受精卵对IVF-ET或ICSI-ET结局的影响——附259个周期分析. 新医学， 2009， 40（4）： 241-243.

[7] Tao T， Robichaud A， Mercier J， Ouellette R. Influence of group embryo culture strategies on the blastocyst development and pregnancy outcome. J Assist Reprod Genet，2013，30（1）：63-68.

[8] Sun B， Yu W， Wang F， Song W， Jin H， Sun Y. Effects of group culture on the development of discarded human embryos and the construction of human embryonic stem cell lines. J Assist Reprod Genet，2014，31（10）：1369-1376.

[9] Minasi MG， Fabozzi G， Casciani V， Lobascio AM， Colasante A， Scarselli F， Greco E. Improved blastocyst formation with reduced culture volume： comparison of three different culture conditions on 1128 sibling human zygotes. J Assist Reprod Genet，2015，32（2）：215-220.

[10] De Munck N， Santos-Ribeiro S， Mateizel I， Verheyen G. Reduced blastocyst formation in reduced culture volume. J Assist Reprod Genet，2015，32（9）：1365-1370.

[11] Dai SJ， Xu CL， Wang J， Sun YP， Chian RC. Effect of culture medium volume and embryo density on early mouse embryonic development： tracking the development of the individual embryo. J Assist Reprod Genet，2012，29（7）：617-623.

（收稿日期：2018-08-22）

（本文編辑：林燕薇）