王荣华　朱成龙　纪茜茜

[摘要]甲拌磷作为一种有机磷农药，因在农业种植中被广泛使用，對环境及人畜健康造成了许多危害，建立快速、灵敏的甲拌磷农药残留检测方法具有重要的意义。本文基于适配体技术，结合FAM和纳米金组建了荧光传感器，对甲拌磷农药残留进行检测，并对水样进行了加标回收验证。结果表明，本方法的特异性强、灵敏度好、检测过程耗时短、操作简便，可用于甲拌磷农药残留的实际检测，对于检测其他有机磷农药具有较大潜力。

[关键词]适配体技术;荧光传感器;甲拌磷;农药残留

中图分类号：TS207

文献标识码：A

DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190411

我国作为农业大国，由于农药的广泛使用，农产品中农药残留引起的安全问题受到了大众的广泛关注。有机磷农药是当下现代农业中应用最广泛的化学农药之一，因其活性高、使用方便、成本低廉，常用于防治蜘蛛、螨虫等昆虫的咀嚼啃食1-21。然而许多有机磷农药具有高毒性，对人类和动物的安全构成严重风险B1。甲拌磷是一种高毒的有机磷农药，国家已严格限制其登记及使用，但其在土壤、水源等环境中的残留仍会对人体健康和生态环境造成危害。作物、环境样品中甲拌磷残留的检测对维护社会公共安全具有非常重要的意义。目前农药的检测大多依赖各种色谱分析方法，这些色谱分析方法具有高灵敏度和准确性，但其对精密仪器、耗时的样品预处理和训练有素的人员的需求，限制了其在现场快速检测中的应用4。相比于色谱法检测，适配体传感器方法相较于传统方法更方便、经济，可以实现快速、特异和高灵敏度的现场检测。适配体大多是短的单链寡核苷酸（RNA或DNA），对于目标物的结合具有高亲和力和选择性，与抗体相比，适配体具有特异性高、分子量小、靶点范围广、操作简便等优点。荧光检测具有灵敏度高、信号转导方便、响应快等优点，本研究设计了一种6-羧基荧光素（FAM）和纳米金（AuNPs）结合的荧光适配体传感器，用于检测甲拌磷农药残留71。

1材料与方法

1.1实验材料

有机磷农药适配体序列参考Zhang等8）的研究，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，ssDNA适配体序列为5’-FAM-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3’。

氯化钠（NaCl）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCl）、氯化钾（KCl）、氯金酸（HAuC4·4H20）：国药集团化学试剂有限公司;甲拌磷、毒死蜱、啶虫脒、吡虫啉、马拉硫磷、敌敌畏农药标准品：AccuStandard公司。

1.2主要设备

UV-3600PLUS型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司;BSA124S型电子天平：赛多利斯公司;F-7000型荧光分光光度计：日本电子株式会社;涡旋振荡器：德国艾卡公司。

2实验方法

2.1纳米金的制备

所有制备用的玻璃器皿都用王水（3份浓盐酸加1份浓硝酸配置而成）浸泡过夜，然后用超纯水清洗，在使用前烘干。采用经典的柠檬酸盐还原法制备了平均直径为13nm的AuNPs'。将HAuCl4（1.0mmol/L、100mL）加热至沸腾，然后在快速搅拌下添加柠檬酸钠（38.8mmol/L、10mL），混合物的颜色从淡黄色变为酒红色。煮沸15min后停止加热，使溶液自然冷却至室温，制备得到的AuNPs在49C下储存备用。将制备的胶体金水溶液滴加10μL至覆有碳膜的铜网上，烘干后采用透射电镜（JEM2110，200kV）对金纳米粒子进行表征，计算直径约为13nm。根据朗伯一比尔定律，利用519nm处的吸光度和13nm的AuNPs消光系数为2.7x10L/（mol.cm）计算得出AuNPs的浓度约为13.0nmol/L"0。

2.2甲拌磷的检测

在1.5mL的离心管中加入40μL、0.2μmol/L的FAM-Apt，20μL、2mg/L不同浓度的甲拌磷标准溶液或实际样品和100μL、pH为7.2的50mmol/L的Tris-HCl（含10mmol/L的NaCl、10mmo/L的KCl），混匀后分别反应20min，加入40μL、2.5nmol/L的AuNPs混匀后反应10min，测定527nm处的荧光强度值，整个检测过程大约耗时30min。

2.3特异性试验

通过分别添加毒死蜱、啶虫脒、吡虫啉、马拉硫磷、敌敌畏等农药对本方法进行特异性验证。在1.5mL的离心管中加入40μL、0.2μmol/L的FAM-Apt，分别加入20μL、2mg/L所有不同农药标准溶液和100μL、pH值为7.2的50mmol/L的Tris-HC（含10mmol/L的NaCl、10mmol/L的KCl），混匀后分别反应20min，加入40μL、2.5nmol/L的AuNPs混匀后反应10min，测定527nm处的荧光强度值川。

2.4水样实际样品加标回收率测定

采集江南大学内小蠡湖湖水进行加标回收率的测定。该水样经0.22μm滤膜过滤后，分别添加1mg/L、2mg/L、3mg/L的甲拌磷标准溶液进行527nm处的荧光强度值的测定，每个加标浓度重复测定3次，计算各个浓度的加标回收率。

3结果与分析

3.1甲拌磷的荧光检测原理

荧光传感器检测甲拌磷原理见图1。单链DNA会通过AuNPs和氮原子之间的配位作用和静电相互作用吸附在带负电的AuNPs表面，FAM是一种在497nm激发、在527nm处发射荧光的有机小分子荧光染料，而AuNPs在480～540nm有很强的紫外吸收。将修饰了FAM的有机磷农药的核酸适配体（FAM-Apt）和AuNPs混合，基于单链DNA和AuNPs之间的吸附作用及FAM与AuNPs之间的荧光共振能量转移作用，FAM的荧光会被AuNPs猝灭。如果在体系中加入目标物有机磷农药，FAM-Apt会和有机磷农药特异性结合，从而使FAM-Apt从AuNPs表面脱离，FAM的荧光出现一定恢复，恢复程度与甲拌磷的浓度成比例关系，可以通过检测计算荧光恢复值对甲拌磷进行定量。

3.2纳米金溶液的表征

纳米金的透射电镜图见图2。本实验制備得到的纳米金呈统一的圆球形，在水溶液中有良好的分散性，对纳米金的直径进行统计分析，得出纳米金直径在13nm左右。纳米金的紫外吸收光谱见图2，本实验制备得到的纳米金在520nm处有最大的紫外吸收峰。

3.3反应条件优化

由于适配体和目标物的结合需要一定的时间，因此对于FAM-Apt和甲拌磷的孵育时间进行了优化，分别孵育不同时间的荧光结果见图4。另外，单链DNA即适配体对AuNPs的吸附程度与时间有关，对AuNPs的猝灭时间也进行了优化，加入AuNPs后反应不同时间的荧光猝灭结果见图5。同浓度的纳米金的猝灭效果不同，也影响目标物存在时的荧光恢复程度，纳米金的优化结果见图6。FAM-Apt和甲拌磷之间的相互作用在20min后达到平衡，加人10min后AuNPs不再猝灭FAM荧光，纳米金浓度为2.5nmol/L，加人甲拌磷后的荧光恢复最强。分别采用20min、10min作为反应时间，纳米金浓度选择2.5nmol/L。

3.4甲拌磷的荧光分析灵敏度及选择性

在最佳条件下，研究了不同浓度甲拌磷下的荧光变化值，结果见图7。据图7可知，随着甲拌磷浓度的增加，FAM在527nm处的荧光值逐渐升高，以527nm处的荧光变化值△F对甲拌磷浓度作图。当甲拌磷浓度为0.5～5mg/L时，△F与甲胺磷浓度呈线性关系，标准曲线为y=53.904x+5.2116，线性相关系数R2为0.9944，检测限为0.27mg/L（3Sd/k），甲拌磷浓度的标准曲线见图8。为了验证本方法的特异性，选择了5种常用的农药进行特异性检测，分别是毒死蜱、啶虫脒、吡虫啉、马拉硫磷、敌敌畏，检测步骤同甲拌磷，结果见图9，加入其他几种农药不会引起527nm处出现明显的荧光变化，说明该方法对于甲拌磷的特异性较好，能够实现对甲拌磷的特异性检测。

3.5水样加标回收率测定

选取了小蠡湖的湖水进行加标回收测定。加标前，对前处理过的湖水样品进行了检测，结果表明，过膜后的湖水样品对基本不会造成荧光变化，说明该前处理方法可基本消除湖水样品的基质效应影响。前处理后的湖水样品作为空白样品进行加标检测，分别在不同加标浓度下重复3次，计算得到各个靶标的回收率见表1。不同加标浓度下的平均回收率为93.5%～112.4%，说明该方法在实际样品检测中具有可行性。

4结论

本实验利用修饰了FAM荧光染料的适配体和纳米金建立了一种基于适配体技术的荧光传感器，并应用于甲拌磷农药的快速检测。本方法在线性范围内线性关系良好，应用于湖水样品检测得到了理想的加标回收率，具有良好的应用前景，在其他有机磷农药的检测中也具有很大潜力。由于FAM荧光染料的光漂白较为严重，同时容易受到检测体系的干扰，该方法的线性范围不够广，灵敏度有待提高，但相比于大型的仪器分析检测方法，该方法的耗时较短、成本较低、检测简单，在实际样品的快速筛查中有很大的发展空间，为适配体技术在农药残留分析检测领域，尤其在快速检测方面的应用提供了发展思路。

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