袁滨 柯丽娜 黄艺宁 张志鸿 连燕萍 张丹凤

摘 要：【目的】准确、科学地鉴定灰树花菌株，明确其亲缘关系。【方法】采用拮抗和ISSR分子标记对供试的11个灰树花菌株进行鉴定和遗传多样性分析。【结果】拮抗反应表明，供试菌株之间拮抗作用有一定差异，根据拮抗反应的有无，供试菌株分为4组。ISSR分子标记分析表明，当相似性系数达到0.87水平时，供试菌株聚成5组，第1组包括菌株1（石家庄灰树花）、2（台灰）、10（XG-W）、5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圆）;第2组为菌株11（CN-9）;第3组为菌株4（Gr0003）;第4组包括菌株8（H）、9（Hokto）;第5组为菌株3（Gr20）。【结论】拮抗反应与ISSR两种方法结论较一致，推测石家庄灰树花与台灰，Gr0001+2、CN与雪圆，H与Hokto这3组菌株分别来源于同一个菌株，属于同种异名现象Gr0003、H和Hokto亲缘关系较远;Gr20与其他菌株亲缘关系最远。

关键词：拮抗;ISSR技术;灰树花;鉴定;聚类分析

中图分类号：S 646文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）04-393-07

Abstract： 【Objective】To reliably identify strains of Grifola frondosa and precisely determine the genetic relationship among them. 【Method】The identification and genetic diversity analysis on 11 strains of G. frondosa were carried out by the combined use of the antagonistic challenging test and ISSR. 【Result】The antagonistic test on the strains demonstrated apparent differences on their responses. Presence or absence of antagonism allowed the classification of the strains into 4 distinct groups. Meanwhile， from the ISSR analysis， when the similarity coefficient reached 0.87， the strains were clustered into 5 groups. They were Group 1 that included Strain #1 （Shijiazhuang ash tree flower）， Strain #2 （stage ash）， Strain #10 （XG-W）， Strain #5 （Gr0001+2）， Strain #6 （CN）， and Strain #7 （snow circle）; Group 2， Strain #11 （CN-9）; Group 3， Strain #4 （Gr0003）; Group 4， Strain #8 （H） and Strain #9 （Hokto）; and， Group 5， Strain #3 （Gr20）. 【Conclusion】It appeared that Strain #1 and Strain #2 belonged to a same species; so were Strains #5， Strain #6 and Strain #7， and Strains #8 and Strain #9. At the similarity coefficient of 0.8， Strain #4 could be clustered with Strain #8 and Strain #9 with slight differences indicating a distance on genetic relationship among them. Strain #3 had a lowest coefficient of 0.34， therefore， it was most remotely related to all.

Key words： antagonistic effect; ISSR; Grifola frondosa; identification; cluster analysis

0 引言

【研究意义】灰树花Grifola frondosa又名栗蘑、贝叶多孔菌、千佛菌等，属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌属[1-3]，是一种珍贵的药、食两用真菌。灰树花子实体肉质鲜美，口感脆嫩可口，富含多種维生素、蛋白质和氨基酸，且药用价值较高，含有多种活性成分[4]，具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、抗氧化、免疫调节、降低血脂等医疗保健作用[1，5-10]，是非常有市场前景的珍稀食用菌[11]。近年来灰树花在我国栽培面积不断扩大，但由于起步较晚，生产中使用的品种主要来自野生驯化或引进日本品种，存在适应能力差、生物转化率低、品种比较单一等缺点[12]。为了适应不断扩大、多样化的市场需求，亟需新的优良的灰树花品种。杂交育种作为食用菌常规育种的主要方法[13]，亲本选择是杂交育种最关键的因素。但现在市场上灰树花品种较为混乱，有些食用菌制种户，相互引种后，又冠上新名，导致灰树花同种异名，同名异种现象普遍存在，这一方面严重损害栽培户的生产积极性，另一方面也不利于科研工作者开展杂交育种工作。因此，收集鉴定主栽的灰树花菌株，分析其亲缘关系，为今后的杂交育种提供依据具有重要的现实意义。 【前人研究进展】拮抗反应是真菌体细胞不亲和性的具体体现[14]，可用于鉴定食用菌品种遗传差异，利用菌株之间的拮抗反应判断两者的亲缘关系。具有操作简单，快速的优点[15]，但对于遗传背景较相近的菌株难以鉴别[16]。如体细胞亲和的菌株可能为同一菌株，也可能存在遗传差异，表现为拮抗线弱或无。即两个菌株没有拮抗反应，则不能确定是相同菌株。因此拮抗只能作为食用菌菌株鉴定的初步方法。而分子生物学方法能直接从 DNA水平上反映其遗传关系，更客观和准确[17]。ISSR是以PCR技术为核心，基于简单重复序列扩增多态SSR建立的一种分子标记技术[18]，广泛用于食用菌菌株鉴定、遗传多样性分析及杂交育种等方面[19]，ISSR技术结合了RAPD和SSR方法的优点，具有稳定性强、重复性高的特点[20]。王春晖等[21]等利用ISSR和RAPD标记对8个灰树花栽培菌株进行遗传多样性分析，16个ISSR引物将8个菌株分为4个大类。温志强等[22]利用RAPD、ISSR、SRAP等3种DNA分子标记分别对不同来源的30个灰树花菌株进行鉴别，在D=0.77的相异系数水平上，可以将30个灰树花菌株分为10个类群，其中包括6个单一类别和4个复合类群。【本研究切入点】ISSR分子标记在灰树花菌株鉴定上有一定的应用，但目前鲜见采用拮抗和ISSR-PCR相结合对灰树花菌株进行鉴定和遗传多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究采用拮抗和ISSR-PCR相结合对收集的11个灰树花菌株进行鉴定和遗传多样性分析，以期更准确、更科学鉴定收集的灰树花菌株，确定其亲缘关系，为杂交亲本选配及今后的新品种的育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的灰树花菌株11个，具体信息来源见表1。

1.2 试验试剂

DNA提取试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司;Taq酶、dNTPs、10×Buffer缓冲液、Mg2+等均购自TaKaRa公司（大连）;ISSR引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成;其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 L，121℃灭菌20 min。

1.4 试验方法

1.4.1 拮抗试验

在超净工作台，将活化后的供试菌株，转接到同一平板上，按品字形接种3个不同菌株。置于25℃恒温培养箱培养，观察不同菌株菌丝间的拮抗反应情况。试验设置3个重复。

1.4.2 供试菌株DNA提取DNA提取采用试剂盒。

1.4.3 ISSR-PCR扩增体系

选用20个ISSR引物对供试菌株进行扩增。引物信息具体见表2，ISSR-PCR扩增体系见表3。

1.4.4 ISSR-PCR反应程序及电泳

ISSR-PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，44-50℃退火45 s，72℃ 延伸1 min 循环数35个，最后72℃ 延伸10 min。

扩增产物检测：取扩增产物7 μL，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5 μg·mL-1 GoldviewTMDNA 染料），160 V恒压1.5 h，紫外凝胶成像系统照像。

1.5 数据分析

拮抗反应是根据NY/T1845-2010食用菌菌种区別性鉴定方法判断。ISSR-PCR反应分析是针对扩增产物进行分析，将试验出现的稳定性条带记为1，无条带记为0，构建“0-1”矩阵表，利用公式[23]算出多态位点百分率P。用NTSYS-pc 2.0软件进行聚类分析，并形成供试菌株的遗传聚类图。

公式为：P=k/n （100%）。

式中，P为多态位点百分率，k为多态性位点数，n为位点总数。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的拮抗反应

供试菌株有3种典型的拮抗反应，如图1所示。菌株1与菌株5无拮抗反应，这两个菌株与菌株3拮抗反应强烈，表现为菌丝隆起。菌株8与菌株9无拮抗反应，这两个菌株与菌株4拮抗反应明显，表现为拮抗线。菌株2与菌株10拮抗反应极其不明显，这两个菌株与菌株4拮抗反应明显，表现为沟状。

根据拮抗反应的有无，形成供试菌株间的拮抗反应情况（表4）。由表4 可以看出，菌株 1、2、5、6、7、10、11两两之间没有拮抗线或拮抗性反应极不明显，说明这些菌株之间亲缘关系较近，分为第一组;菌株8与菌株9之间没有拮抗线，但与其他菌株均有明显拮抗线，分为第二组;菌株3、菌株4两两之间及与其他菌株之间均有明显拮抗反应，说明菌株3、菌株4亲缘关系较远，菌株3为一组，菌株4分为另外一组。综上所述，通过拮抗反应分析可以将11个灰树花菌株分成 4 组。

2.2 供试菌株的ISSR多态性分析

试验选取能够扩增出稳定特异条带、多态性好、条带清晰的20条引物，分别为P1、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P16、P17、P18、P19、P20、P23、P25、P26、P28。图2为引物P1和P2扩增供试菌株的指纹图谱。20条引物对供试菌株均扩增出稳定的条带，多态性条带在8～18条，扩增出的DNA大小在100～2 200 bp。20条ISSR引物对供试菌株共扩增出260条稳定性条带，其中多态性条带达234条，多态性比率为90.0%。

2.3 供试菌株聚类分析

从图3可以看出，当相似性系数达到0.87时，供试菌株聚成5组，第1组包括菌株1（石家庄灰树花）、2（台灰）、10（XG-W）、5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圆）;第2组为菌株11（CN-9）;第3组为菌株4（Gr0003）;第4组包括菌株8（H）、9（Hokto）;第5组为菌株3（Gr20）。

供试菌株之间的遗传相似系数在0.34～1.00，其中相似系数为1的有菌株1、2;菌株5、6、7;菌株8、9。菌株10与菌株1、2相似性系数为0.98。表明这几组菌株之间亲缘性非常近。菌株11与菌株1、2、10、5、6、7的相似性系数为0.76，菌株11与这几个菌株有一定的差异性，亲缘关系较远。菌株4与菌株8、9的相似性系数为0.84，菌株4与菌株8、9有一定的差异性，亲缘关系较远。菌株3与其他菌株相似系数最小，为0.34，说明菌株3与其他菌株亲缘关系最远。

3 讨论与结论

传统的食用菌菌株鉴别主要采用形态特征观察的方法[24]，由于在栽培过程中，子实体形态特征会受到环境条件、栽培管理技术等因素的影响，出现较大的差异，因此单纯使用形态学指标分类比较困难。拮抗反应是体细胞不亲和性的具体体现[25]，具有操作方便、易于观察的特点。在本试验中，拮抗现象有隆起型、拮抗线、沟状，拮抗反应较明显。菌株 1、2、5、6、7、10、11两两之间没有拮抗线，说明这些菌株之间亲缘关系较近;菌株8与菌株9之间没有拮抗线，但与其他菌株均有明显拮抗线;菌株3、菌株4两两之间及与其他菌株之间均有明显拮抗反应，说明菌株3、菌株4亲缘关系较远。

分子标记技术通过扩增供试菌株相关基因片段，寻找差异基因，因此利用分子标记对菌株进行鉴定分类具有准确、快速的特点[26]。ISSR技术大量应用在食用菌遗传多样性分析、杂交育种、品种鉴定等方面。如张介驰等[27]采用ISSR鉴别27个东北地区黑木耳生产菌株， ISSR揭示的DNA指纹多态性高，可以有效快速准确鉴别黑木耳生产菌株。秦莲花等[28]结合ITS与ISSR技术，作为香菇生产菌株鉴别。因此本试验采用ISSR分子标记的方法进行供试菌株鉴定。本试验中，当相似性系数达到0.87水平时，供试菌株聚成5组，说明供试菌株具有丰富的遗传多样性。

有研究结果表明采用拮抗分类鉴定结果与其他鉴别方法的结果吻合。如金针菇拮抗反应分类与RAPD分析结果吻合[29]。拮抗反应和RAPD在灵芝亲缘关系的鉴定结论一致[18]。杏鲍菇[30]、姬菇[31]、姬松茸[32]、香菇[28]等也存在这样的现象。本试验采用拮抗反应和ISSR-PCR两种方法综合鉴定供试的11个灰树花菌株。结果表明这两种方法所得到的结果存在一致性。如菌株1、2、5、6、7、10这7个菌株之间没有拮抗反应，而在ISSR聚类分析时，相似性系数为0.96时，菌株1、2、10、5、6、7聚在一类，亲缘关系较近，其中菌株1和菌株2，相似性系数为1，菌株10与菌株1、2相似性系数为0.98。菌株5和菌株6、菌株7相似性系数为1。而菌株3与其他所有菌株拮抗反应非常强烈，在ISSR聚类分析时单独聚为一类，且与其他菌株的相似性系数为0.34，遗传距离最远。

但拮抗反应和ISSR分子标记分析还是有一定的差异，如在拮抗反应中，菌株11与菌株1、2、5、6、7、10没有拮抗线，说明菌株11与这几个菌株间遗传背景较相似，亲缘关系较近。而在ISSR分子标记中，在相似性为0.76时菌株11与菌株1、2、5、6、7、10聚在一起。说明拮抗反应不能有效区分两个在遗传背景相似或亲缘关系很近的菌株[16]，因此可以通过拮抗反应进行初步分类，再通过分子标记的方法进行深入研究。

综合这两种方法，推测菌株1（石家庄灰树花）与菌株2（台灰）为同一个菌株，属于同种异名现象。推测菌株5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圆）为同一个菌株，属于同种异名现象。推测菌株8（H）、9（Hokto）为同一个菌株，也属于同种异名现象。菌株3（Gr20）、菌株4（Gr0003）为不同菌株。单纯依靠拮抗和分子标记方法作为分类学分析是不全面的，试验结果还需要通过观察子实体农艺性状及生理生化指标进一步验证上述几组菌株是否为同种异名现象。

杨军等[33]采用ISSR和RAPD两种分子标记的方法对供试的40株菌株进行鉴定，发现利用两种分子标记比单独使用分子标记鉴定的结果准确，菌株类别划分更精细。王守现等[34]采用酯酶同工酶聚类分析，将6个灰树花菌株分为3大类，RAPD和ISSR引物验证，其结果与酯酶同工酶分析的一致。因此可以进一步采用其他分子标记验证本试验结果。

在本试验中，菌株3与其他菌株差异非常大，有必要对其进行ITS测序，判断是否为灰树花菌株。

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