孟海宁 高钿 仵俊宇 黄巧 徐晟伟 沈若武

[摘要] 目的 探究miRNA-375（miR-375）通過MYC/上皮间质转化（EMT）对非小细胞肺癌（NSCLC）侵袭和迁移的影响。

方法 将未做任何处理的NSCLC细胞A549作为空白组，转染空载慢病毒的A549细胞作为对照组，转染表达miR-375慢病毒的A549细胞作为实验组。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测miR-375在NSCLC组织和癌旁组织中的表达量，以及miR-375在正常肺组织细胞（BEAS-2B细胞）和A549细胞中的表达量;通过Transwell实验检测3组细胞的侵袭、迁移能力;采用Western blot检测3组细胞中MYC蛋白和EMT相关蛋白（E-钙黏蛋白、波形蛋白）的表达量。

结果 miR-375在NSCLC组织中的表达量显著高于癌旁组织（t=16.88，P<0.05），在A549细胞中的表达量显著高于BEAS-2B细胞（t=8.51，P<0.05）。过表达miR-375后，实验组与空白组和对照组相比，NSCLC细胞的侵袭（F=29.55，P<0.05）、迁移（F=90.21，P<0.05）能力增强，MYC蛋白表达增加（F=37.15，P<0.05），E-钙黏蛋白表达减少（F=47.25，P<0.05），波形蛋白表达增加（F=77.64，P<0.05）。

结论 上调miR-375可以通过MYC/EMT影响NSCLC的侵袭和迁移能力。

[关键词] 微RNAs;癌，非小细胞肺;基因，myc;上皮-间质转化;细胞运动

[中图分类号] R734.2;R342.2

[文献标志码] A

[文章编号]  2096-5532（2019）06-0639-05

doi：10.11712/jms201906003

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

MIRNA-375 AFFECTS THE INVASION AND MIGRATION OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER CELLS VIA MYC/EPITHE-

LIAL-MESENCHYMAL TRANSITION

MENG Haining， GAO Tian， WU Junyu， HUANG Qiao， XU Shengwei， SHEN Ruowu

（Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of miRNA-375 （miR-375） on the invasion and migration of non-small cell lung cancer （NSCLC） via MYC/epithelial-mesenchymal transition （EMT）.

Methods NSCLC A549 cells without any treatment were established as blank group， A549 cells transfected with empty vector lentivirus were established as control group， and A549 cells transfected with miR-375 lentiviral vector were established as experimental group. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-375 in NSCLC tissue and adjacent tissue， as well as in BEAS-2B cells and A549 cells. Transwell assay was used to measure the invasion and migration abilities of A549 cells， and Western blot was used to measure the expression of MYC protein and EMT-related proteins （E-cadherin and vimentin） in the three groups of cells.

Results The NSCLC tissue had significantly higher expression of miR-375 than the adjacent tissue （t=16.88，P<0.05）， and A549 cells had significantly higher expression of miR-375 than BEAS-2B cells （t=8.51，P<0.05）. After the overexpression of miR-375， compared with the blank group and the control group， the experimental group had significant increases in the abilities of invasion （F=29.55，P<0.05） and migration （F=90.21，P<0.05）， a significant increase in the protein expression of MYC （F=37.15，P<0.05）， a significant reduction in the expression of E-cadherin （F=47.25，P<0.05）， and a significant increase in the expression of vimentin （F=77.64，P<0.05）.

Conclusion Upregulation of miR-375 can promote the invasion and migration of NSCLC through MYC/EMT.

[KEY WORDS] microRNAs; carcinoma， non-small-cell lung; genes， myc; epithelial-mesenchymal transition; cell movement

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，同时也是全球恶性肿瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治疗方法是手术、放疗和化疗，尽管放疗和化疗的应用使NSCLC预后得到很大改善，但其生存率还是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究显得尤为重要。近年来研究结果发现，miRNA对肺癌的进展、诊断以及治疗起着关键作用，其在肺癌的治疗研究中备受关注[5]。miRNA是一类长约20个氨基酸的小RNA，它可以与特定的靶点结合，影响靶位点的mRNA翻译，进而影响相关蛋白的表达[6]。有研究表明，miRNA-375（miR-375）与肿瘤的侵袭、转移和凋亡有着密切的联系，而且miR-375的表达与癌症病人的总生存率相关，所以推测miR-375可能是一种有用的临床预后生物标志物[7-8]。JUNG等[9]研究发现，MYC可以受miR-375的调节进而影响肿瘤的进展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，对肿瘤细胞的侵袭、迁移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些药物可以通过抑制MYC通路的激活来抑制人宫颈癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化（EMT）[12];hsa-miR-24则可以通过调节c-MYC/EMT轴来抑制鼻咽癌细胞的转移能力[13];MYC还可以通过抑制RPS19/EMT信号传导的激活来抑制癌细胞的转移[14]。本研究旨在探讨miR-375是否可通过MYC/EMT对NSCLC的侵袭和迁移产生影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与样本

所用NSCLC细胞（A549）和正常肺组织细胞（BEAS-2B）由青岛大学博雅楼实验室冻存。A549细胞用RPMI-1640（HyClone，美国）培养液培养，BEAS-2B细胞用LHC-9（HyClone，美国）培养液培养，培养细胞时两种培养液都加入体积分数0.10胎牛血清（索莱宝，北京）。含EDTA的胰蛋白酶（索莱宝，北京）用于消化贴壁细胞。NSCLC组织和癌旁组织的新鲜样本各30例，来自青岛市市立医院。本研究的组织来源病人均签署了书面同意书，研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 细胞转染

将A549细胞接种于96孔板中，每孔10 000个，置于含体积分数0.05 CO2的37 ℃培养箱中培养24 h。实验共分3组，在96孔板中未做任何处理的A549细胞作为空白组，将转染含空载体慢病毒（吉凯基因公司，上海）的A549细胞作为对照组，将转染表达miR-375慢病毒（吉凯基因公司，上海）的A549细胞作为实验组。将3组细胞置于培养箱继续培养10 h后，移除96孔板中的培养液，更换新的培养液，每孔100 μL。然后继续培养72 h，应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测3组细胞中miR-375的表达量。

1.3 qRT-PCR

收集长势良好的细胞，按照iso plus RNA提取试剂盒（Takara，日本）的说明书提取3组细胞的总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，日本）将RNA反转成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A（Takara，日本）进行qRT-PCR，检测细胞中miR-375的表达。反应条件：95 ℃、30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环;60 ℃、15 s。实验所用引物均购自上海生工，其中U6作为miRNA-375的内源性参照。引物序列见表1。

1.4 Transwell小室实验

①迁移实验：向24孔板（康宁，美国）的3个孔中加入含体积分数0.15胎牛血清的培养液，每孔500 μL，将3个Transwell小室（康宁，美国）分别放入3个孔中。取3组细胞各5×104个分别接种于以上3个Transwell小室内，置于细胞培养箱中培养24 h后取出，用棉签擦拭3个Transwell小室的内膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在显微镜下计数细胞。②侵袭实验：将基质胶（康宁，美国）与完全培养液按1∶9的比例稀释，将稀释后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培养箱中4 h，其余实验步骤同迁移实验。

1.5 Western blot檢测

取3组细胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用细胞刮刀将细胞刮下分别放入3个离心管中，以5 000 r/min离心5 min。去上清留细胞沉淀，在细胞沉淀中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心10 min，上清即为总蛋白。将提取的蛋白质加入上样缓冲液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳结束后将胶中的蛋白条带转移到PVDF膜上（Millipore，美国）。用脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下与MYC（1∶1 000，CST）、β-actin（1∶3 000，Bioss）、E-钙黏蛋白（E-cadherin，1∶1 000，CST）、波形蛋白（Vimentin，1∶1 000，CST）的一抗一起孵育过夜;加入二抗（1∶1 000，Abcam）低速振荡60 min。用超敏型化学发光底物试剂（ECL）进行蛋白条带成像，分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料结果以±s形式表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05表示差异有显著性。

2 结 果

2.1 miR-375的表达

2.1.1 NSCLC组织和癌旁组织miR-375表达的比较 癌旁组织和NSCLC组织miR-375的相对表达量分别为0.40±0.20和1.00±0.03，NSCLC组织miR-375的表达明显高于癌旁组织，差异有显著性（t=16.88，P<0.05）。

2.1.2 BEAS-2B细胞和A549细胞miR-375表达的比较 BEAS-2B细胞和A549细胞miR-375的相对表达量分别为1.00±0.02和2.20±0.30，A549细胞miR-375的表达明显高于BEAS-2B细胞，差异有统计学意义（t=8.51，P<0.05）。

2.1.3 各组细胞miR-375表达的比较 实验组细胞miR-375的表达较空白组和对照组明显增加，差异有显著性（F=1 677.95，P<0.05），而空白组和对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2 miR-375对细胞侵袭和迁移能力的影响

与空白组和对照组相比，实验组细胞的迁移、侵袭能力均增强，差异有显著意义（F=90.21、29.55，P<0.05），而空白组和对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 miR-375对MYC蛋白表达的影响

与空白组和对照组相比，实验组细胞MYC的表达增加，差异有显著意义（F=37.15，P<0.05），而空白组和对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 miR-375对EMT相关蛋白表达的影响

与空白组和对照组相比，实验组细胞E-cadhe-

rin的表达降低，Vimentin的表达升高，差异均有显著性（F=47.25、77.64，P<0.05），而空白组和对照组E-cadherin和Vimentin的表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图1和表3。

3 讨 论

肺癌是全球范围内很常见的一种肿瘤，NSCLC在所有肺癌类型中发病率最高[15]。NSCLC确诊时多数已发生侵袭转移，这是其死亡率高的主要原因，所以研究影响NSCLC侵袭和转移的靶点显得尤为重要。miRNAs是小分子内源性非编码RNA，可以影响基因表达的转录后调控，从而起到肿瘤抑制基因或致癌基因的作用[16-17]。已有大量的证据表明，miRNAs对NSCLC的进展有影响[18-19]。在众多的miRNAs中，越来越多的研究集中在miR-375上，miR-375与癌症总体生存率显著相关，并且对多种癌症的侵袭、转移、生长和分化产生作用[8，20]。但miR-375在NSCLC中的研究较少，它对NSCLC的影响还不甚明确，所以本研究选择了miR-375作为NSCLC的研究靶点。

本研究结果显示，miR-375在NSCLC组织中呈高表达，与相关研究结果一致[21]，推测miR-375在NSCLC中起促癌基因的作用。进一步的实验结果显示，过表达miR-375后细胞的侵袭和迁移能力增强，表明miR-375可以调节NSCLC的侵袭迁移能力，并且是起促癌基因的作用。但是也有研究结果显示，miR-375在肺癌、食管癌、肝细胞癌中呈低表达[22-24]。目前miR-375在癌症中具体的作用还不确定，其是否能作为癌症治疗的靶点还有待进一步证实。目前，综合本实验结果和相关文献可以看出，miR-375既可以为癌基因，也可以为抑癌基因，

它在不同肿瘤中的作用不同。MYC癌蛋白为“超级转录因子”，可以调控基因组15%左右的转录，其下游效应子可以参与核糖体生物合成、蛋白质翻译、协调细胞增殖和分化等生物功能[25-26]。本文实验结果显示，过表达miR-375后NSCLC细胞MYC蛋白的表达水平升高，表明miR-375可以通过调节MYC的表达来影响NSCLC的侵袭和迁移。EMT是一个动态变化的过程，在该过程中稳定的上皮细胞转化为不稳定的、具有转移和侵袭能力的间质细胞，故EMT在肿瘤的发生发展中扮演着不可或缺的角色[27-28]。MYC也可以通过调节EMT的发生发展来影响肿瘤进展[29]。本实验结果表明，随着miR-375的过表达，NSCLC细胞的MYC表达显著增加，侵袭和迁移能力显著增强，EMT相关蛋白的表达也发生明显变化，提示miR-375可以通过MYC/EMT影响NSCLC细胞的侵袭和迁移能力。

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