黄霜 陈素琴

【摘要】 Crouzon综合征是一种罕见的常染色体显性遗传性颅缝早闭症，其致病基因是成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）基因。该文收集1例颅面部发育异常男性患儿的临床资料并进行综合分析;提取患儿及其父母的外周血DNA，采用PCR扩增FGFR2基因的全部18个外显子及剪接位点序列，对PCR产物进行直接测序。结果显示，患儿携带了FGFR2 c.1024T>C（p.Cys342Arg）突变，患儿的双亲该位点均为正常的T碱基。FGFR2基因突变在该家系中表现为新发突变;但不排除患儿双亲之一为该突变的生殖系嵌合体。该例检测结果证实了p.Cys342Arg为FGFR2基因的突变，p.Cys342Arg突变可引起Crouzon综合征。

【关键词】 Crouzon综合征;成纤维细胞生长因子受体2;基因突变

Genetic analysis of FGFR2 gene mutation in a child with Crouzon syndrome Huang Shuang， Chen Suqin. Department of Laboratory， Panyu Hexian Memorial Hospital， Guangzhou 510530， China

Correspondence author， Chen Suqin， E-mail： chensq@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】 Crouzon syndrome is a rare dominantly inherited disorder characterized by craniosynostosis， and the pathogenic gene is the fibroblast growth factor receptor 2 （FGFR2） gene. In this paper， the clinical data of a Chinese boy with craniofacial malformation were collected and comprehensively analyzed. The DNA sampling was extracted from the peripheral blood of the affected child and his parents. All 18 exons and the intron-exon splice sites of FGFR2 gene were amplified by polymerase chain reaction （PCR）. The results showed that the patient carried a heterozygous mutation c.1024T>C（p.Cys342Arg）in the FGFR2 gene. Both of the parents showed the normal T at the same nucleotide. FGFR2 gene mutation was present as de novo mutation. However， the possibility of one of his parents carrying the chimera of this gene mutation could not be excluded. The detection results confirmed that p.Cys342Arg was the hotspot mutation in FGFR2 gene， which accounted for Crouzon syndrome.

【Key words】 Crouzon syndrome;Fibroblast growth factor receptor 2;Gene mutation

Crouzon綜合征（MIM 123500）是一种罕见的先天性遗传病，是由于颅骨冠状缝过早骨化闭合而引起的颅面部发育异常。其临床主要表现为颅缝过早闭合、颅面部发育不良、眼球突出、眼眶浅、眼距宽、外斜视、鹰钩鼻、上唇短、上颌缩小、下颌前突等，患者通常四肢发育正常[1]。63% 的病例会出现颅内高压，随颅压增高，可出现不同程度的智力低下[2]。该病由法国神经病学家 Octave Crouzon于1912年首次报道，呈常染色体显性遗传，发病率约为16.5/1 000 000[3]。其致病基因是成纤维细胞生长因子受体2（ FGFR2， MIM 176943），位于10q26.13，编码FGFR2蛋白（NP_000132.3）基因，属酪氨酸激酶受体家族成员，在物种进化中氨基酸序列高度保守[4]。目前全世界已发现的引起Crouzon综合征的FGFR2基因的致病性突变有51种以上（http：//www.hgmd.cf.ac.uk）。笔者对1例Crouzon综合征患儿进行FGFR2基因的突变分析，旨在查明该病的遗传学病因。

病例资料

一、病史及相关检查

患儿男，8岁，足月顺产第1胎。出生体质量3 000 g，生后即发现患儿面容特殊，临床拟诊为“颅面部发育不良”。患儿父母要求“行遗传学分析”，遂于2018年6月26日到中山大学中山医学院医学遗传学教研室检查。该家庭来自广东，汉族。父母健康，非近亲婚配，双方家系中均无遗传病史。

体格检查：发育正常，营养良好，生命体征正常。舟状头，眼距宽，眼球突出，眼眶浅，外斜视，鹰钩鼻，上唇短，上颌缩小，下颌前突。一侧外耳道闭锁，上下齿呈反咬合，牙齿排列不齐。智力发育未见明显迟缓。四肢发育未见异常。其他系统未见明显异常。

影像学检查：出生6个月时头部MRI平扫显示：头颅呈方形，双侧侧脑室体部及前角略大，颅内未见异常信号影，颅内脑质形态、结构正常，脑髓鞘化与月龄相符;脑室、脑池形态、大小正常、中线结构未见移位;脑沟和脑裂未见异常;颅骨未见异常信号影;双侧眼球突出。1岁时头颅螺旋CT扫描+三维显示：双侧脑室、第三脑室稍扩张;颅骨呈方形改变，前囟未闭;颌面骨及双侧颧弓稍狭小、塌陷。2岁时头颅CT扫描显示：双侧脑室、第三脑室稍扩张;颅骨呈方形改变，前囟未闭（较前稍有发育）;颌面骨及双侧颧弓稍狭小、塌陷。6岁时颅脑多层螺旋CT平扫显示：脑实质未见明显异常密度灶;脑室系统无变形;脑沟、脑池无增宽;中线结构居中无移位;颅骨骨质连续性无中断;双侧上颌窦黏膜增厚，提示上颌窦炎症。

二、遗传学分析

经患儿家属知情同意，并经中山大学伦理委员会批准后，取患儿及其父母外周血2 ml，按常规酚/氯仿/异戊醇抽提法抽提基因组DNA。

对患儿及其父母的FGFR2基因的全部18个外显子及其剪接位点进行直接序列分析。根据NM_000141.4序列，从UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu）中获取人类FGFR2基因的DNA序列。以在线软件Primer3（http：//frodo.wi.mit.edu/）进行引物设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反应体系为30 μl，含1×PCR Buffer、4 种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各20 mmol/L、氯化镁2.5 mmol/L，上游和下游引物各0.33 μmol/L、Taq DNA聚合酶（MBI）1.5 U， 基因组DNA约0.1 ～ 0.7μg。热循环条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s、60 ℃退火45 s、72 ℃

延伸1 min 30 s，共35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收纯化，并直接测序。测序结果用Chromos Lite 2.1.1软件（Technelysium公司）进行分析，所得序列与数据库中的FGFR2基因序列进行比对。变异位点的描述按人类基因组变异协会所推荐的命名法则（http：//varnomen.hgvs.org/），即+1位为NM_000141.4中转录起始密码子ATG中的A[5]。

测序结果显示，患儿FGFR2基因第8外显子存在突变c.1024T>C（p.Cys342Arg），使第342位密码子TGC变为CGC，导致正常的半胱氨酸（C）变为精氨酸（R），即p.Cys342Arg错义突变。患儿的父亲、母亲该位点均为正常的T碱基，见图1。患儿被诊断为颅型Crouzon综合征。

讨 论

颅缝早闭症是由于颅缝过早闭合引起的先天性异常，一般分为非综合征型和综合征型，其中后者除了颅缝早闭外，还伴有身体其他部位的畸形，如面部、大脑、四肢畸形，甚至出现颅内压升高、脑发育迟缓、癫痫发作等[6]。Crouzon综合征是颅缝早闭症中最常见的一种，占所有颅缝早闭症的4.8%。颅缝早闭的顺序和范围影响了畸形的严重程度。颅缝最早可在出生前或围产期融合，也可发生于婴儿期和儿童期。颅缝融合过程开始得越早，对儿童颅骨生长发育的影响越大[7]。根据患儿不同程度的颜面畸形，Crouzon综合征可分为5种类型：①上颌型，以中面部的后缩、凹陷为主要特征;②假性型，主要变现为突眼畸形;③颜面型，有典型的突眼、中面部后缩和反颌畸形;④颅型，除颜面型的特征外，还有短头、颌窦发育不良等症状;⑤颅面型，所有症状均可出现，并有明显的颅内压升高、眶距增宽等伴随症状[8]。另外，还存在一种特殊的出生后才表现的Crouzon综合征亚型，即患者出生时颅缝无明显闭合，但出生后数月或数年随颅缝进行性闭合而出现明显的临床症状。本研究中患儿出生时即出现明显症状，主要表现为突眼、中面部发育不良及反颌畸形，属于颅型Crouzon综合征。

FGFR2基因是Crouzon综合征的致病基因，其编码产物FGFR2蛋白（NP_000132.3），属于FGFR家族成员[9]。FGFR具有4个结构类似的成员：FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，分别由4个独立的基因编码，均属酪氨酸激酶受体。FGFR2是一种跨膜蛋白，主要由3部分组成：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区为配体结合区，由3 个典型的免疫球蛋白样（Ig-like）结构域（IgⅠ、IgⅡ、IgⅢ）和IgⅠ、IgⅡ间的酸性区构成。FGFR2 的IgⅢ的mRNA 可以选择性剪接，从而形成不同亚型的受体。FGFR结合配体的特异性取决于IgⅢ。IgⅢ的N-端由外显子Ⅲa编码，C-端由外显子Ⅲb或者Ⅲc编码，产生FGFR2b和FGFR2c两种亚型的蛋白。FGFR2b主要在上皮细胞中表达，FGFR2c主要在间质细胞中表达。FGFR2与多个成纤维细胞生长因子（FGF）配体结合，参与FGF的信号传递，在骨缝形成和肢芽发育过程中发挥重要作用[10]。FGFR2基因的表达异常与骨骼系统疾病、关节炎和肿瘤等疾病的发生发展密切相关;其中与肿瘤相关的疾病包括乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、食管癌、胆管癌和膀胱癌等[11]。

迄今全世界已发现的FGFR2基因突变约159种（http：//www.hgmd.cf.ac.uk，HGMD Professional 2019. 1版本）。FGFR2 基因突变与至少9种不同的临床综合征有关，包括Crouzon 综合征、Pfeiffer综合征、Apert综合征、Jackson-Weiss综合征、Beare-Stevenson Cutis Gyrata综合征、Saethre-Chotzen综合

征、Lacrimo-auriculo-dento-digital等。其中导致Crouzon综合征的突变类型最多，超过51种;其余依次是Pfeiffer 综合征（27种）、其他颅缝早闭症（11种）、Apert综合征（9种）、Jackson-Weiss综合征（6种）。Crouzon综合征与其他颅缝早闭综合征的主要区别在于患者四肢发育正常;而Pfeiffer综合征伴有短粗、弯曲的大拇指和大脚趾，Apert综合征伴有手足并指/趾畸形（又称“尖头并指/ 趾畸形”），Jackson-Weiss综合征伴有足部畸形。95%引起Crouzon综合征的突变集中在Ⅲa和Ⅲc。本研究患儿的c.1024T>C（p.Cys342Arg）突变位于FGFR2基因的第8外显子（NM_000141.4），编码FGFR2蛋白IgⅢ的C-端Ⅲc区。p.C342是该基因突变的热点，可发生各种氨基酸替代：Cys342Arg、Cys342Gly、Cys342Ser、Cys342Trp、Cys342Phe和Cys342Tyr[12-17]。Cys342是该外显子唯一的半胱氨酸，该氨基酸形成的二硫键对维持蛋白质结构起着非常重要的作用。有学者认为，FGFR2基因中半胱氨酸的替代是Crouzon综合征的主要原因[18]。半胱氨酸的替代，形成了异常的蛋白质二级结构，彻底改变了蛋白质的终产物。突变蛋白的酪氨酸激酶活性增强，产生不依赖配体刺激的系统[19]。有趣的是，Cys342的不同突变可表现为不同的综合征，甚至同一突變可表现为不同的综合征，如与本研究中患者相同的Cys342Arg突变，可导致Crouzon综合征、Pfeiffer综合征和Jackson-Weiss综合征[13-14， 16， 19]。这反映了修饰基因或表观遗传在决定疾病的最终表型中起了一定的作用[20]。

Crouzon综合征患者30% ～ 60%为散发病例，

表现为新发突变。Glaser等[21]通过分子遗传学分析证实了部分散发病例的突变来自父源，认为Crouzon综合征与父本的年龄效应有关，即父亲年龄越大，更易携带生殖系突变。研究显示，携带FGFR2功能获得性突变的精原细胞受到了正向选择作用而更有生存优势，也有学者（Goriely等，2010年）发现有些散发病例的突变来自生殖系嵌合体的母亲。本研究中患儿的双亲均未携带相同的突变，表现为新发突变;患儿的父亲婚育年龄并不大（为30岁），不支持Crouzon综合征与父本的年龄效应有关的假说;但不排除患儿双亲之一为该突变的生殖系嵌合體。

Crouzon综合征目前尚无有效根治方法;部分患者可通过手术进行重塑矫正来改善畸形和缓解症状，但部分患者伴有不同程度的智力低下[8]。因此，携带者的检出及开展产前诊断与产前基因诊断，对于防止Crouzon综合征重症患儿的出生、改善人口素质，具有重要的意义。

参 考 文 献

[1] Robin NH， Falk MJ， Haldeman-Englert CR. FGFR-related Craniosynostosis syndromes. In： Adam MP， Ardinger HH， Pagon RA， Wallace SE， Bean LJH， Stephens K， Amemiya A， editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle （WA）： University of Washington， Seattle; 1993-2019. Available from http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1455/

[2] Abu-Sittah GS， Jeelani O， Dunaway D， Hayward R. Raised intracranial pressure in Crouzon syndrome： incidence， causes， and management. J Neurosurg Pediatr，2016; 17（4）：469-475.

[3] Al-Namnam NM， Hariri F， Thong MK， Rahman ZA. Crouzon syndrome： genetic and intervention review. J Oral Biol Craniofac Res，2019，9（1）：37-39.

[4] Reardon W， Winter RM， Rutland P， Pulleyn LJ， Jones BM， Malcolm S. Mutations in the fibroblast growth factor receptor 2 gene cause Crouzon syndrome. Nat Genet，1994，8（1）：98-103.

[5] den Dunnen JT， Dalgleish R， Maglott DR， Hart RK， Greenblatt MS， McGowan-Jordan J， Roux AF， Smith T， Antonarakis SE， Taschner PE. HGVS recommendations for the description of sequence variants： 2016 update. Hum Mutat，2016，37（6）：564-569.

[6] Wang JC， Nagy L， Demke JC. Syndromic Craniosynostosis. Facial Plast Surg Clin North Am，2016，24（4）：531-543.

[7] 王世玉，吕长胜. Crouzon综合征的诊断及治疗进展.中国美容医学， 2012，21（7）：1273-1277.

[8] Mathijssen IM. Guideline for care of patients with the diagnoses of Craniosynostosis： Working Group on Craniosynostosis. J Craniofac Surg，2015，26（6）：1735-1807.

[9] Azoury SC， Reddy S， Shukla V， Deng CX. Fibroblast growth factor receptor 2 （FGFR2） mutation related syndromic Crani-osynostosis. Int J Biol Sci，2017，13（12）：1479-1488.

[10] Moosa S， Wollnik B. Altered FGF signalling in congenital crani-ofacial and skeletal disorders. Semin Cell Dev Biol，2016，53：115-125.

[11] Tuzon CT， Rigueur D， Merrill AE. Nuclear fibroblast growth factor receptor signaling in skeletal development and disease. Curr Osteoporos Rep，2019，17（3）：138-146.

[12] Ke R， Yang X， Tianyi C， Ge M， Lei J， Mu X. The C342R mutation in FGFR2 causes Crouzon syndrome with elbow deformity. J Craniofac Surg，2015，26（2）：584-586.

[13] Paumard-Hernández B， Berges-Soria J， Barroso E， Rivera-Pedroza CI， Pérez-Carrizosa V， Benito-Sanz S， López-Messa E， Santos F， García-Recuero II， Romance A， Ballesta-Martínez JM， López-González V， Campos-Barros Á， Cruz J， Guillén-Navarro E， Sánchez Del Pozo J， Lapunzina P， García-Miñaur S， Heath KE. Expanding the mutation spectrum in 182 Spanish probands with Craniosynostosis： identification and characterization of novel TCF12 variants. Eur J Hum Genet，2015，23（7）：907-914.

[14] Tartaglia M， Di Rocco C， Lajeunie E， Valeri S， Velardi F， Battaglia PA. Jackson-Weiss syndrome： identification of two novel FGFR2 missense mutations shared with Crouzon and Pfeiffer craniosynostotic disorders. Hum Genet，1997，101（1）：47-50.

[15] Ma HW， Lajeunie E， Le Merrer M， de Parseval N， Serville F， Weissenbach J， Munnich A， Renier D. No evidence of genetic heterogeneity in Crouzon craniofacial dysostosis. Hum Genet，1995，96（6）：731-735.

[16] Meyers GA， Day D， Goldberg R， Daentl DL， Przylepa KA， Abrams LJ， Graham JM Jr， Feingold M， Moeschler JB， Rawnsley E， Scott AF， Jabs EW. FGFR2 exon IIIa and IIIc mutations in Crouzon， Jackson-Weiss， and Pfeiffer syndromes： evidence for missense changes， insertions， and a deletion due to alternative RNA splicing. Am J Hum Genet，1996，58（3）：491-498.

[17] Lin Y， Gao H， Ai S， Eswarakumar JVP， Zhu Y， Chen C， Li T， Liu B， Jiang H， Liu Y， Li Y， Wu Q， Li H， Liang X， Jin C， Huang X， Lu L. FGFR2 mutations and associated clinical observations in two Chinese patients with Crouzon syndrome. Mol Med Rep，2017，16（5）：5841-5846.

[18] Steinberger D， Mulliken JB， Müller U. Predisposition for cysteine substitutions in the immunoglobulin-like chain of FGFR2 in Crouzon syndrome. Hum Genet，1995，96（1）：113-115.

[19] Park WJ， Meyers GA， Li X， Theda C， Day D， Orlow SJ， Jones MC， Jabs EW. Novel FGFR2 mutations in Crouzon and Jackson-Weiss syndromes show allelic heterogeneity and phenotypic variability. Hum Mol Genet，1995，4（7）：1229-1233.

[20] Helman SN， Badhey A， Kadakia S， Myers E. Revisiting Crouzon syndrome： reviewing the background and management of a multifaceted disease. Oral Maxillofac Surg，2014，18（4）：373-379.

[21] Glaser RL， Jiang W， Boyadjiev SA， Tran AK， Zachary AA， Van Maldergem L， Johnson D， Walsh S， Oldridge M， Wall SA， Wilkie AO， Jabs EW. Paternal origin of FGFR2 mutations in sporadic cases of Crouzon syndrome and Pfeiffer syndrome. Am J Hum Genet，2000，66（3）：768-777.

（收稿日期：2019-01-30）

（本文編辑：洪悦民）