李庆元 肖微微 张本旭 邢翔

摘 要：筛选具有利用食用油脂功能的菌株，为废弃食用油脂的资源化应用开展基础性前期研究。利用油脂中性红平板筛选法筛选到1株具有脂类降解能力的菌株鉴定为蒙氏假单胞菌。通过菌株形态特征扫描、生理生化特性，进而利用分光光度法探索了该菌株最适温度、最适pH等生长条件。并研究其在最适生长条件下的生长曲线及其在不同油脂作唯一碳源条件下的生长情况。结果表明，该菌株生长的最适温度为28℃、最适pH值为7.0、最适盐度为2g/L，达到最大培养生物量的时间为7h。对玉米油、动物油、花生油、芝麻油、椰子油、橄榄油共7种食用油脂具有相应的利用能力。

关键词：蒙氏假单胞菌;食用油脂;利用效率

随着人民生活水平的提高和城市第三产业的发展，我国餐饮产业正以每年10%以上的速度递增[1]，食用油脂作为重要的餐饮原料，其使用量随之增加。废弃食用油脂回流食品市场所造成的危害已经引起人们的高度重视。统计数据显示，我国年产废弃油高达500万t，以京津为例，2016年达到30万t左右。大量地沟油若放任自流经非法渠道流向食用油、饲料油市场，将会严重危及食品安全[2]。而且废弃食用油脂一旦作为污染物进入环境，造成环境压力不可估量[3]。目前，处理废弃食用油脂的途径有厌氧发酵、生产炸药、化工重利用和生物降解[4-7]等途径。本研究利用海洋微生物资源高效转化效率的特点，以油、脂为原料，探索菌株对其利用度，为进一步降解处理废弃食品油脂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品

蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii），山东省海洋微生物资源中心保藏。

1.2 培养基

（1）TSB培养基（g/L）：胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g。（2）油脂中性红培养基（g/L）：橄榄油6mL、吐温-80℃ 20mL、氯化钠5g、磷酸二氢钾2g、无水硫酸镁0.1g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸铵1g、硝酸钾1g、0.8%中性红水溶液2mL、琼脂18g、纯水1 000mL，pH 7.2，121℃灭菌20min。（3）发酵培养基（g/L）：橄榄油6mL、吐温-80℃ 20mL、氯化钠5g、磷酸二氢钾2g、无水硫酸镁0.1g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸铵1g、硝酸钾1g、纯水1 000mL，pH 7.2，121℃灭菌20min。（4）油脂培养基（g/L）：油脂6mL、吐温-80℃ 20mL、氯化钠2g、磷酸二氢钾2g、无水硫酸镁0.1g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸铵1g、硝酸钾1g、纯水1 000mL，pH 7.5，121℃灭菌20min。

1.3 菌株的活化与生化特性

1.3.1 活化 取冷冻管，常温解冻，取200μL涂布于分离培养基上，20～25℃培养24～48h。挑取单菌落，再次纯化。

1.3.2 培养特征与形态 将纯化出的菌株接种到油脂中性红培养基平板，28℃恒温培养48h，观察菌落生长及培养基变色。将纯化后的菌株接种至TSB培养基，25℃培养24h，观察单菌落的大小、形状、颜色、透明度和色泽特征。同时以戊二醛前处理菌体，邮寄青岛大学扫描电镜观察。

1.3.3 生理生化特征 将斜面琼脂中生长的菌苔刮取至ATB菌液管中，配制成浊度0.5麦氏单位。接种20E、ZYM、ATB-ID32试剂条中，28±1℃培养 18～24h观察结果，并由ATB NEW细菌鉴定仪判读结果[9]。

1.3.4 最适生长条件 自油脂中性红培养基上挑取菌种接种到发酵培养基中，28℃、110r/min的条件下培养48h。以1%的接种量接种到初始pH为5.5～9.0的发酵培养基中，28℃、110r/min的条件下培养48h，测定600nm处的吸光度，判断最佳的pH。同理，设定不同的盐度1～6g/L，设计温度15～37℃，培养48h后在600nm处测定其吸光度，判断最佳生长条件。

1.3.5 最适生长条件下脂降解菌的生长曲线测定 自油脂中性红培养基上挑取菌种接种到发酵培养基中，28℃、110r/min的条件下培养48h。以1%的接种量接种到初始pH为7.0、初始盐度为2g/L的发酵培养基中，在110r/min、28℃的条件下培养。测定菌液在1～9h时在600nm处的吸光度，绘制生长曲线。

1.3.6 最適生长条件下对不同油脂的利用效率 自油脂中性红培养基上挑取菌种接种到发酵培养基中，28℃、110r/min的条件下培养48h。以1%的接种量分别接种到玉米油培养基、花生油培养基、动物油培养基、芝麻油培养基、椰子油培养基、橄榄油培养基中，在初始pH为7.0、初始盐度为2g/L、28℃、110r/min的条件下培养。培养48h后在600nm处测定其吸光度。

2 结果与分析

2.1 Pseudomonas monteilii的形态及生理生化特征

将获得纯培养的Pseudomonas monteilii菌株接种于TSB培养基，置25℃培养，菌落呈乳黄色、隆起状，边缘不规则，表面光滑（图1）。菌株革兰氏染色后呈红色，为革兰氏阴性菌。电镜照片显示其为具鞭毛的短杆状（图2）。生理生化检测结果表明，油脂降解菌Pseudomonas monteilii可利用梓檬酸钠，并可产生萘酚-AS-BI-磷酸酶和脲酶（附表）。

2.2 最适生长条件

设定的培养基初始pH为5.5～9.0，自油脂中性红培养基上挑取菌种接种到发酵培养基中，28℃、110r/min的条件下培养48h。同理，设定不同的盐度1～6g/L，不同的温度15～37℃，培养48h后在600nm处测定其吸光度，得到最佳的生长条件为初始pH 7.0、初始盐度2g/L、培养温度28℃（图3）。

2.3 最适生长条件下Pseudomonas monteilii生长曲线

在最适pH、盐度、温度条件下摇瓶培养Pseudomonas monteilii，培养1～9h后测定菌液在600nm处的吸光度。图4表明，Pseudomonas monteilii在最适条件下培养7h即可达到。

2.4 最适生长条件下Pseudomonas monteilii对不同种油脂的利用效率

设定的油脂种类有玉米油、动物油、花生油、芝麻油、椰子油、橄欖油，初始pH为7.0、盐度为2g/L、温度为28℃，培养48h后利用分光光度计法测定菌液在600nm处的吸光度。图5表明，Pseudomonas monteilii在多种油脂中均能生长，在玉米油、花生油、芝麻油中生长情况较好，具有利用多种油脂生长增殖的能力。

3 结论

废弃食用油脂回流餐桌已成为社会公害，引起人们的极大重视，多地相继出台法规规范、监管废弃食用油脂的去向[8-9]。废弃油脂的处理目前多采用生物技术，包括固定化微生物技术、PAC生物处理技术、UASB法[10-12]，以及超临界 CO2 分解技术[13]等。对于微生物利用废弃食用油脂也有报道，韩德军等[14]、冯兰等[15]和陈红艳等[16]对葡萄球菌、厚壁菌、假单胞菌利用动植物油能力的研究[14-16]。本研究从初始pH、初始盐度、温度三方面确定了Pseudomonas monteilii的最适生长条件。该菌株对盐度的适应范围广泛。并测定了在最适条件下，Pseudomonas monteilii的生长曲线。其油脂效率较快，短时间内即可达到最大吸收峰。通过对其在不同种油脂中生长情况的研究，发现该种菌可在多种油脂中增殖到较高浓度，具有降解多种油脂的能力。现今已有多项研究表明，Pseudomonas monteilii产生的活性物质可破坏TMV粒体，对病毒产生钝化作用，使病毒粒体缺乏完整性，从而无法在寄主体内增殖，降低病毒的侵染能力[17-18]。本研究对菌株利用废弃食用油脂培育生防生物制剂，应用于植物病毒病的生物防治提供了科学依据。

参考文献

[1]刘婕.除油菌的筛选鉴定及油脂废水处理研究[D].广州：华南理工大学，2010.

[2]仝晓波.地沟油能源化利用 国内理应有大作为[N].中国能源报，2019-05-13（001）.

[3]张飞.S5和Y2菌对石油烃和废弃食用油脂的分解与同化作用研究[D].西安：西安建筑科技大学，2011.

[4]李凛，张云飞，李强，等.废弃食用油脂中温厌氧发酵特性研究[J].中国沼气，2016，34（5）：27-31.

[5]岳中文，于强，李玉清，等.废食用油在混装多孔粒状铵油炸药中的应用[J].工程爆破，2015，21（4）：1-5、44.

[6]姜加群.浅谈废弃食用油脂的危害与资源化利用[J].农技服务，2015，32（12）：231.

[7]黄志立，任源，韦朝海，等.1株好氧菌对不同油脂的降解[J].环境污染与防治，2001（4）：197-199.

[8]吕永刚，王昕昕，杨芬，等.青岛市餐厨废弃食用油脂管理工作成效[J].中国环保产业，2016（4）：65-67.

[9]陈美珠，陈伟锋.广州市餐饮废弃物处理现状与立法管理研究[J].环境卫生工程，2015，23（3）：6-9.

[10]赵亚乾，等.固定化微生物技术用于餐厅污水处理的实验研究[J].广州环境科学，1997，12（3）：26-28.

[11]陆光立.植物油精炼废水处理工艺研究[J].上海环境科学，1996（6）：30-33.

[12]陈秉良，金章旭，刘东风，等.上流式厌氧污泥床预处理油脂废水的研究[J].环境工程，1992，10（3）：6-10.

[13]Feral Temelli，Jerry W.King，Gary R.List.Conversion of oils to monoglycerides by glycerolysis in supercritical carbon dioxide media[J].Journal of the American Oil Chemists Society，1996，73（6）：669-706.

[14]韩德军，潘丽梅.餐饮废水的微生物降解技术初步研究[J].东北师大学报（自然科学版），2009，41（2）：182-185.

[15]冯兰，等.植物油降解细菌的培养条件优化和分离鉴定[J].青岛理工大学学报，2017，38（1）：87-94.

[16]陈红艳，等.低温高效植物油脂降解菌的筛选与特性[J].环境科学研究，2009，22（12）：1466-1471.

[17]袁莲莲，等.蒙氏假单胞菌3A菌株对烟草漂浮育苗中TMV的钝化效果[J].植物保护，2017，43（2）：37-42.

[18]翟熙伦.蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）的活性小分子物质对TMV、PVY的抑制作用[D].北京：中国农业科学院，2012.

（责任编辑 唐建敏）