刘婷婷 邢青斌 唐艳斌 陈璐 孙静 黄建 霍军生

摘 要：目的：对乳粉中氨基酸分析的水解方法进行研究，比较牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中氨基酸的含量。方法：样品用含巯基乙酸的盐酸溶液水解提取，经定容、过滤、真空浓缩、复溶、过膜后，用氨基酸分析仪测定，外标法定量。结果：应用含0.05%巯基乙酸的盐酸水解液对奶粉样品进行水解的同时有效防止了蛋氨酸的氧化，相对氧化水解方法节省前处理时间，方法的回收率为94%～97%，相对标准偏差小于3.0%。通过对牛乳基和羊乳基奶粉样品中的16种氨基酸分析，牛乳基奶粉中赖氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他相应氨基酸含量不存在显著性差异。结论：该方法准确快速、重现性好，适用于奶粉中氨基酸含量分析的检测要求。

关键词：氨基酸;奶粉;牛乳基;羊乳基;氨基酸分析仪

近些年，羊乳基粉和牛乳基粉营养组成及营养价值受到较多关注，但作为主要乳营养成分的蛋白质的氨基酸，在我国市场上羊乳基粉和牛乳基粉产品中的比较研究尚未见报道。氨基酸主要以结合态氨基酸和游离氨基酸形式存在。游离氨基酸可直接取样提取后检测，结合态氨基酸需将蛋白水解后进行测定。国内外学者对其进行大量研究，由于大部分氨基酸无荧光发射和紫外吸收特性，需通过衍生后进行检测[1]，研究人员开发出柱前衍生的阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法[2]、高效液相色谱法[3-6]、液相色谱质谱联用法[7-9]等，上述方法所需前处理步骤复杂，分析时间较长，重现性不是很稳定，且消耗人力、物力较大。近些年，氨基酸分析仪被广泛应用于氨基酸分析，低pH条件下带正电荷的各种氨基酸在阳离子交换树脂上被吸附，随着不同离子强度、pH值的流动相依次洗脱下来，分离纯化后用茚三酮衍生的色谱法，该方法灵敏、快速、重现性好，数据可靠。

本研究对乳基粉中氨基酸测定的前处理过程进行优化，使用氨基酸分析仪进行分析，建立了快速、准确、可靠的16种氨基酸含量测定方法。通过分析不同牛乳基奶粉和羊乳基奶粉产品中氨基酸的成分和含量，得到其特征图谱，为今后评价原材料和相应产品质量的优良性、真实性提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品和试剂

奶粉样品：分别采购自四川、内蒙、新疆、宁夏、青海、甘肃、重庆、广西、贵州、云南的商场和超市。涉及婴幼儿配方奶粉、孕妇奶粉、中老年奶粉，去除调制乳和乳基不明确的乳粉，筛选出70份牛乳基奶粉和18份羊乳基奶粉样本。

氨基酸标样，日本Wako公司;质控品（SRM 1849A婴儿/成人营养配方），美国NIST;盐酸（优级纯），天津试剂公司;巯基乙酸，美国Sigma公司;氨基酸分析仪配套的流动相（茚三酮溶液和缓冲液），日本Wako公司;实验用水为MilliQ纯水仪制的。

1.2 仪器和设备

L-8900型氨基酸分析仪，日本日立公司;电热恒温干燥箱，上海森信;浓缩仪，东京理化公司;氮吹仪，美国Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量的测定 参照国标方法（GB 5009.5—2016）[10]，称取约0.20g样品，同时做样品空白管，每管分别加入5.0mL浓硫酸和催化片（K2SO4 1.5g;Se 0.007 5g），过夜，次日，置消化器消化6h，待消化完全后用凯式自动定氮分析仪测定氮含量，计算得到其蛋白质含量。

1.3.2 氨基酸的测定 参照国标方法（GB 5009.124—2016）[11]原理测定16种氨基酸，并对样品预处理做出调整。称取奶粉样品约0.10g于酸水解管中，在水解管内加10mL 6mol/L盐酸（含0.05%巯基乙酸），充入高纯氮气后封口，将已封口的水解管放入110℃的恒温鼓风箱中，水解22h后取出冷却。将水解管内全部液体转移到50mL容量瓶内，多次冲洗水解管，用去离子水定容。将定容水解液过滤后，吸取1mL于10mL浓缩管中，应用真空浓缩仪，在55℃水浴中浓缩，残留物用1mL水溶解后浓缩至干，用2.0mL 0.02moL/L盐酸复溶，过滤后供仪器测定。准确吸取标准储备溶液，用0.02mol/L稀盐酸稀释配制得到0.10μmol/mL混合标准溶液。

色谱条件：色谱柱：水解氨基酸色谱柱（4.6mm×60mm，3μm）;检测波长：570、440nm;反应柱温度：135℃;分析柱温度：57℃;进样体积：20μL;洗脱溶液流速：0.4mL/min;柱后衍生试剂流速：0.35mL/min。

1.3.3 数据分析 用外标法分别测定筛选出的70份牛乳基样本和18份羊乳基样本中16种氨基酸的含量，应用SRM 1849A婴儿/成人营养配方粉作为质控验证分析数据的准确性，通过SAS 9.4软件，用中位数[四分位间距（quartile，QR）]表示，采用Wilcoxon秩和检验比较组间差异。

2 结果与分析

2.1 氨基酸测定方法的改进

2.1.1 色谱分离效果 使用氨基酸分析仪，采用阳离子色谱柱分离后茚三酮在线衍生的方法，该方法灵敏准确、重现性好。从图1～2可以看出，基线平稳，色谱峰窄而尖，分析时间短，分离效果好。在实际奶粉樣品中，目标峰也与其他杂质峰分离良好。

2.1.2 检出限及定量限 在上述分析条件下，结合称样量，前处理过程和复溶后的定容体积，以3倍信噪比计算方法检出限（LOD），10倍信噪比计算方法定量限（LOQ）（表1）。

2.1.3 分析条件优化及准确性评估 蛋氨酸作为含硫氨基酸，在酸水解过程中，容易被氧化而导致测定值比实际含量值偏低，因此，蛋氨酸回收率的提高是保证酸水解氨基酸检测结果是否准确的关键。为此，本研究采用3种不同的前处理水解液对样品进行回收率试验，并比较了上机前氮气浓缩和真空浓缩的效果（表2）。在样品前处理过程中，加入含0.05%巯基乙酸的盐酸水解法对样品中蛋氨酸的水解保护效果较好。因巯基乙酸具有巯基和羟酸的反应特征，直接对蛋白类样品进行水解的同时，还可有效防止蛋氨酸被氧化，减少了氨基酸前处理过程中的氧化损失。加入巯基乙酸的盐酸水解液法相对氧化保护后酸水解法分析步骤相对简单，节省前处理时间，回收率达到94%～97%，高于原国标方法采用的方法（回收率 89%～93%），相对标准偏差（RSD）小于3.0%，真空浓缩仪赶酸富集过程样品中的氨基酸更稳定，不易被空气氧化，重现性好，表明此方法有较好的重复性，准确可靠。

2.2 奶基中氨基酸比较

应用氨基酸分析仪对来自牛乳基和羊乳基样品中的16种氨基酸进行分析，NIST的婴儿/成人营养配方粉1849A作为质控品，对蛋白质和相应的氨基酸进行质量控制，试验所得的质控品氨基酸含量在靶值范围内。各氨基酸含量总和基本等于其蛋白质的含量，也间接证明了本方法测定乳粉中氨基酸含量的准确性。根据对70份牛乳基奶粉和18份羊乳基样本的分析，蛋白质含量平均为15%（11%～22%）。牛奶基和羊奶基奶粉中均含有丰富的氨基酸，种类齐全，包括丝氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等（表3）。

3 结论

本研究通过对乳基奶粉中氨基酸分析的前处理条件进行优化研究，在盐酸水解液中加入巯基乙酸对含硫的蛋氨酸进行保护，相比传统酸水解方法减少氧化损失，其分析步骤相对简单，准确可靠，重现性好，为进一步开展奶粉氨基酸成分及含量的相关研究提供科学依据。通过氨基酸分析仪对国内市场上销售的牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中16种氨基酸进行测定，发现牛乳基奶粉中酪氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他种类的氨基酸含量在牛乳基和羊乳基奶粉中不存在显著性差异，为今后相关产品的质量评价提供参考。

参考文献

[1]高燕红，朝阳，鲁琳.应用柱前衍生法和柱后衍生法测定氨基酸方法的比较[J].中国医学检验杂志，2004，5（2）：133-135.

[2]于泓，丁永胜，牟世芬.阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法分离测定氨基酸注射液中的氨基酸和葡萄糖[J].色谱，2002，20（5）：398-401.

[3]Langrock T，Czihal P，Horrmann R.Amino acid analysis by hydrophilicinteraction chromatography coupled on-line to electrosprayionization mass spectrometry[J].Amino Acids，2006（30）：291-297.

[4]李玉玲，李卫华，杨秀清.反相高效液相色谱法检测奶粉中含硫氨基酸[J].食品科学，2012，33（8）：167-170.

[5]Guo S，Duan JA，Qian DW，et al.Rapid determination of amino acids in fruits of Ziziphusjujuba by hydrophilic interaction ultra-high-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole mass spectrometry[J].Agric.Food Chem，2013（61）：2709-2719.

[6]Zhang LL，Bai YL.，Shu SL，et al. Simultaneous quantitation of nucleosides，nucleobases，amino acids and alkaloids in mulberry leaf by ultra high performance liquid chromatography with triple quadrupole tandem mass spectrometry[J].Sep.Sci，2014（37）：1265-1275.

[7]Xiang X，Sha X，Su S，et al.Simultaneous determination of polysaccharides and 21 nucleosides and amino acids in different tissues of Salvia miltiorrhiza from different areas by UV-visible spectrophotometry and UHPLC with triple quadrupole MS/MS[J].Sep Sci，2018（41）：996-1008.

[8]Zhu S，Guo S，Duan JA，et al.UHPLC-TQ-MS coupled with multivariate statistical analysis to characterize nucleosides，nucleobases and amino acids in AngelicaeSinensis Radix obtained by different drying methods[J].Molecules，2017（22）：918-933.

[9]UbhiBK，Davenport PW，Welch M，et al.Analysis of chloroformate-derivatised amino acids，dipeptides and polyamines by LC-MS/MS[J].Journal of Chromatogr aphyB，2013（934）：79-88.

[10]中華人民共和国卫计委GB 5009.5—2016 食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

[11]中华人民共和国卫计委GB 5009.124—2016 食品中氨基酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.

（责任编辑 唐建敏）