冯汉宇 魏建华 王旭明 张殿朋 岳跃森 欧阳

摘   要：为了明确花青素在籽粒和幼苗组织细胞内的累积分布，采用徒手切片，在显微镜下观察京501、京24、A-44、A-45和A-40-3株系的籽粒糊粉层和幼苗组织。结果表明：京501和京24糊粉层浅黄色，A-44籽粒糊粉层细胞有红黑色糊粉粒，A-45籽粒糊粉层细胞有红色糊粉粒，A-40-3籽粒糊粉层细胞有黑色糊粉粒，不同放大倍数条件下A-45的糊粉粒都是红色，A-40-3的糊粉粒由黑色变为红黑色;室内条件下京501幼苗胚芽鞘绿色，裸露根系白色，京24幼苗胚芽鞘与裸露根系紫红色，A-44，A-40-3和A-45幼苗胚芽鞘与裸露的根系淡紫红色;田间条件下，京501幼苗胚芽鞘淡紫色，露出根系紫红色，京24、A-44、A-40-3和A-45幼苗胚芽鞘与露出根系深紫红色。结合以上可知，花青素主要分布在糊粉层、紫红鞘和根皮层组织细胞内。

关键词：玉米;切片;花青素;累积分布

文章编号： 1005-2690（2019）01-0094-03       中图分类号： S513; TP391.41       文献标志码： B

玉米的种子由果皮、胚、胚乳、糊粉层及黑色层几部分组成。种子发芽过程中，胚、胚乳和糊粉层能够再利用，胚发育成幼苗，胚乳和糊粉层被分解供幼芽或苗利用;种子萌发期间胚释放出一种植物激素诱发糊粉层产生淀粉酶和合成一些蛋白水解酶，淀粉酶将淀粉转变为可溶的糖类供胚生长，因此糊粉层的生理活动和结构变化关系非常密切 [1]。前人通过切片和显微技术对种子果皮[2，3]、胚乳细胞[4，5]、胚乳传递细胞[6，7]、糊粉层[8]及维管束[9～13]等组织、器官进行了一些研究，而且李广伟（2016）采用姿态调整装置设计提高了育种用玉米种子切片取样自动识别方法的准确性，该方法可为玉米种子自动定向切片问题提供解决方案[14]。但是对于彩色玉米育种用玉米种子切片自动定向问题未能提供解决方案，所以目前还只能采用徒手切片。

本研究以不同颜色糊粉层玉米籽粒为材料，以徒手切片为基础，调查不同颜色玉米种子萌发到苗期的形态变化，并对糊粉层、茎鞘及根进行显微结构观察，力图从发育生物学的角度，初步探讨种子内和幼苗发育期间植株中花青素的累积，以明确其物质分布的结构特点。

1   材料与方法

1.1   试验材料

试验用玉米材料包括：自交系京501，糊粉层黄色;自交系京24，糊粉层黄色;含花青素基因的F5代种子和F6代苗。具体的材料来源参照冯汉宇（2018）[15]，编号A-44株系籽粒糊粉层红色，A-45株系籽粒糊粉层红黑色，A-40-3株系籽粒糊粉层黑色。

1.2   试验方法

1.2.1   切片制作

取不同颜色的玉米籽粒，清水浸泡4 h，剥取种皮和胚，用F.A.A固定液固定去胚和种皮的籽粒24 h，用95%乙醇处理20 min，用80%乙醇处理20 min，用75%乙醇保存，制成切片，采用徒手切片法，把材料徒手切片[16，17]。把一些自交系京501、京24以及含花青素基因的F5代株系种子播种于小红盆中，按时浇水，并把一些株系放在外面田里、一些放在实验室内，观察和记录苗的表型变化，在苗长到7叶期时，取一些7叶期的苗，去掉泥土，用清水洗干净，剪去叶片，截取一部分茎鞘和根，用F.A.A固定液固定24 h，用95%乙醇处理20 min，用80%乙醇处理20 min，用75%乙醇保存，制成切片。

1.2.2   切片观察

徒手进行切片，切片厚度不一，但是均在1 mm以下，采用北京农业生物技术研究中心的Leica荧光正置显微镜观察切片，并用LASV 4.5系统进行显微拍照。

2   结果与分析

2.1   不同显微镜和光源影响图像质量

在进行籽粒切片试验时发现，红色籽粒糊粉层在显微镜自带光源下为紫黑色，与裸眼观察不相符，于是采用显微镜外置光源，发现籽粒糊粉层是红色，白色淀粉层的为黄色，临时采用手机手电筒光源，籽粒糊粉层是红色，淀粉层白色复原，但是透明的載玻片显示红色，与手机图片下的载玻片颜色不一样，于是又做了一些糊粉层切片进行仔细观察，同时加了一些苗期切片认真研究。

2.2   显微镜下的籽粒糊粉层

在正置显微镜观察了京501、京24、A-44、A-45及A-40-3株系籽粒糊粉层，并在物镜10倍、20倍、40倍及100倍条件下观察了A-45和A-40-3糊粉层色泽变化。

由图2可知，京501和京24糊粉层浅黄色，内部有黄色颗粒，A-45红色糊粉层细胞内有红色糊粉粒，A-44红黑色糊粉层细胞内有红黑色糊粉粒，A-40-3黑色糊粉层细胞内有红黑色糊粉粒;在物镜10倍、20倍、40倍及100倍条件下A-45糊粉层都是红色，细胞内糊粉粒红色，A-40-3糊粉层由黑色变为红黑色，主要是细胞内糊粉粒由黑色变为红色。由此可知，放大倍数不同，有些糊粉粒色泽可能不一样。

2.3   苗期表型变化

通过苗期表型观察，发现各个株系苗期表型不一样。

在室内光线微弱的条件下，京501自交系胚芽鞘绿色，露在土壤外面的一些根系是白色的;京24自交系胚芽鞘紫红色，露在土壤外面的一些根系也是紫红色;A-44、A-40-3和A-45这3个株系的胚芽鞘淡紫红色，露在土壤外面的一些根系也是淡紫红色。

室外田间条件下与室内不完全一样，京501自交系胚芽鞘淡紫色，露在土壤外面的一些根系是紫红色;京24自交系胚芽鞘深紫红色，露在土壤外面的根系也是紫红色;A-44、A-40-3和A-45这3个株系的胚芽鞘深紫红色，露在土壤外面的一些根系是紫红色，所以A-44、A-40-3和A-45这3个株系调控胚芽鞘花青素累积的基因可能来自京24。

2.4   茎鞘与根花青素累积

通过正置显微镜观察了一些幼苗的茎鞘、根皮层维管束组织，发现它们的结构和色泽不尽相同。京24、A-44、A-45和A-40-3的鞘大部分紫红色，纵向切片观察发现鞘组织淡紫色，细胞内部有紫色花青素累积物，京501的鞘组织白色，没有紫色花青素小点，它们的茎维管束组织都是白色;京24、A-44、A-45、A-40-3和京501的紫红色根组织皮层细胞有紫色花青素累积物，白色皮层和内部维管束没有花青素累积物。通过以上可知，紫色花青素累积物主要分布在紫红鞘和根皮层组织细胞内。

3   讨论与结论

3.1   结论

3.1.1   显微镜下籽粒组织色泽

显微镜下自交系京501和京24浅黄色籽粒糊粉层含有黄色颗粒，A-44红黑色糊粉层细胞内含红黑色糊粉粒，A-45株系籽粒淀粉层白色，红色糊粉层细胞内有红色糊粉粒，在物镜10倍、20倍、40倍及100倍条件下糊粉层和细胞内糊粉粒都是红色，A-40-3株系籽粒黑色糊粉层在物镜10倍、20倍、40倍及100倍条件下由黑色变为红黑色，主要是细胞内糊粉粒由黑色变为红黑色。由此可知，放大倍数不同，糊粉粒色泽可能不一样。

3.1.2   苗期花青素表型

各个株系苗期表型不同。在室内光线微弱的条件下，京501自交系胚芽鞘绿色，裸露根系白色，京24自交系胚芽鞘与裸露的根系紫红色，A-44、A-40-3和A-45株系胚芽鞘与裸露的根系淡紫红色，室外田间条件与室内不尽相同，京501自交系胚芽鞘变为淡紫色，露出根系紫红色，京24自交系胚芽鞘与露出根系深紫红色，A-44、A-40-3和A-45株系的胚芽鞘与露出的根系深紫红色，所以这3个株系调控胚芽鞘花青素累积的基因可能来自自交系京24。

3.1.3   花青素亚细胞分布

幼苗的茎鞘、根皮层维管束组织结构和色泽有差异。京24、A-44、A-45和A-40-3淡紫色鞘组织细胞内部有紫色花青素累积物，京501的白色鞘组织未发现紫色花青素小点，它们的茎维管束组织都是白色;京24、A-44、A-45、A-40-3和京501的紫红色根皮层细胞内含紫色花青素累积物，白色皮层和内部维管束无花青素累积物。通过以上可知，紫色花青素累积物主要分布在紫红鞘和根皮层组织细胞内。

3.2   讨论

3.2.1   不同光源与切片厚度影响图像质量

有的学者采用荧光标记研究玉米维管束组织，并用染色剂染色，再加上不同色光源观察，只能看到维管束本身，在同一视野下看不清周边组织[18]。若不使用染色剂染色，则为黑白片，看不到彩色花青素在玉米幼苗茎鞘组织中累积[19]。

Badone（2010）采用原位切片技术进行籽粒组织学观察，发现花青素在糊粉层累积[20]。在观察切片的过程中发现不同光源影响切片色彩，切片厚度调节明暗亮度，即使进行纵横切姿态调整，也无法避免有些厚切片由于光线无法透过而不能使用。

四季草茎切片发现花青素累积在紫红色茎皮层细胞内，绿色的茎皮层细胞内没有花青素累积[21]。

采用本色切片技术，没有使用任何染色剂染色，因为籽粒和幼苗本身就是彩色的，通过切片可以看出籽粒糊粉层黄色无花青素累积，不同倍数的红色、红黑色及黑色的糊粉层切片都有彩色糊粉粒。

3.2.2   种子萌发成苗与花青素分布

种子从萌芽到苗期花青素累积既受自身基因的调节，也受外部环境的影响。通过对小麦幼苗胚芽鞘切片观察，发现花青素积累在小麦幼苗胚芽鞘外皮层细胞内，小麦幼苗胚芽鞘分布有紫红色花青素，而绿鞘小麦幼苗观察不到花青素[22]。花青素合成途径是植物次生代谢途径之一，花青素苷种类的多样性则源于其不同分支途径的形成[23]。

不同类型的花青素玉米，其花青素累积与分布不同，爆裂紫玉米花青素主要累积在果皮[24]，而黑玉米花青素可分布在植株和籽粒中[25]。研究发现，除了黑玉米外，红色玉米植株和籽粒也有花青素分布，进一步切片分析发现花青素主要分布于糊粉层细胞、紫红鞘和根皮层组织细胞内。

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（收稿日期：2018-08-29）