江凯 罗海波 姜丽 周涛 陶明煊 王韦华 郁志芳

摘要：利用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）标记结合二维液相色谱一串联质谱（2D-LC-MS/MS）技术，探索乙烯利（ETH）和1一甲基环丙烯（1-MCP）处理对茭白采后贮藏期间线粒体蛋白质表达谱的影响。共鉴定到1 908个特征肽段≥2的可信蛋白质，与贮藏0 d相比，对照、ETH和1-MCP处理的茭白贮藏3 d和6 d共有315个蛋白质具有2.0倍以上显著差异（P<0.05）。基因本体（GO）分子功能分析和KEGG通路分析结果显示，茭白采后贮藏3d，代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢、二羧酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d，光合作用中的碳固定、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解和磷酸戊糖途径相关蛋白质显著富集。ETH处理后贮藏3 d，氧化磷酸化以及甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、磷酸戊糖途径以及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成代谢途径相关蛋白质显著富集。1-MCP处理后贮藏3 d，三羧酸循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解途径相关蛋白质显著富集;贮藏6 d，磷酸戊糖途径、c5支链二元酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢途径相关蛋白质显著富集。以上结果表明，代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径等可能与茭白采后衰老有关，三羧酸循环、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、c5支链酸代谢及相关氨基酸代谢途径可能在茭白采后衰老中发挥重要作用。

关键词：茭白;线粒体;同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）;生物信息学;衰老

中图分类号：$645.2 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0173-09

衰老是茭白采后品质快速劣变和商品价值下降的重要因素，不仅会加速营养成分消耗损失，还会导致茭白因抗病能力下降而霉变甚至腐烂，从而直接影响茭白贮藏寿命和菜农经济利益。茭白采后衰老与活性氧代谢、细胞结构降解、呼吸代谢及其伴随的能量代谢等生理过程密切相关，但采后衰老的分子机制尚不明确。蛋白质是基因表达的产物，是生命活动的具体执行者以及生物细胞各种代谢和调控途径的靶分子，也是联系基因和生命活动的重要桥梁。应用蛋白质组学技术研究茭白采后衰老过程中蛋白质表达谱的变化规律，有助于对茭白采后衰老及其调控的分子机制进行深层次的诠释。

线粒体是存在于绝大多数真核生物细胞内的一种重要细胞器，是细胞进行呼吸氧化、三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化的场所，也是能量产生的场所，在细胞生长发育、信号转导和细胞程序性死亡的过程中，线粒体也发挥了重要作用。对茭白采后线粒体蛋白质差异表达谱进行研究，能够更加深入准确地探明呼吸代谢及其伴随的能量代谢和活性氧代谢在茭白采后衰老中的作用机制。

近年来，利用蛋白质组学技术研究植物线粒体蛋白质表达差异，揭示采后衰老机制的研究逐渐增多。Millar等对拟南芥培养细胞的线粒体蛋白质进行双向电泳分析，显示出大约100个高丰度线粒体蛋白质和250个低丰度线粒体蛋白质，对其中170个蛋白质进行质谱分析，81个蛋白质得到成功鉴定，生物信息学分析结果显示，这些蛋白质在呼吸电子传递链、三羧酸循环、氨基酸代谢、蛋白质运输、膜转运、抗氧化防御、加工、组装和转录中发挥作用。Millar等研究了水稻幼苗在6 d缺氧后1 d有氧适应期和7 d有氧条件下线粒体蛋白质的表达差异，发现缺氧條件下呼吸氧化相关酶活性显著升高，但细胞色素c氧化酶丰度显著低于对照。Qin等研究苹果和桃果实衰老过程中的线粒体蛋白质，发现碳水化合物代谢、三羧酸循环、电子传递链及抗胁迫相关蛋白质存在表达差异，尤其在高氧胁迫下，锰超氧化物歧化酶表达量显著上调。Wu等研究了桃果实采后成熟衰老期间的线粒体蛋白质，发现能量代谢、氧化胁迫与桃果实采后成熟衰老密切相关，其中活性氧（ROS）积累是导致桃果实采后衰老的重要原因。此外，应用线粒体蛋白质组学技术揭示植物细胞质雄性不育机理方面也已有相关报道。然而，关于茭白采后衰老期间线粒体蛋白质的研究较少。

同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是一种体外标记技术，采用4种或8种同位素标签，可与氨基（包括氨基酸N端和赖氨酸侧链氨基）反应，实现连接，再通过质谱分析可同时对最多8种不同样品中的蛋白质进行定性和定量分析，与传统双向电泳（2D-PAGE）和荧光差异双向电泳（2D-DIGE）技术相比，具有通量高、重复性好、定量准确、分辨率高、数据丰富和自动化程度高等优势，目前已广泛应用于水稻、大豆芽、土豆、冬虫夏草、黄瓜、西红柿等植物材料的蛋白质组学研究中。

本试验拟采用iTRAQ标记结合二维液相色谱一串联质谱（2D-LC-MS/MS）技术，对茭白采后常温贮藏期间以及乙烯利（ETH）、1-甲基环丙烯（1-MCP）处理后线粒体蛋白质的表达谱进行比较，筛选差异表达蛋白质并进行生物信息学分析，探索茭白采后衰老的生物学基础，以期为茭白贮运保鲜新技术的开发提供理论依据。

2.4.2 GO分析将筛选到的差异表达蛋白质进行GO分类注释，茭白采后贮藏3 d差异表达蛋白质涉及的前10类生物学过程为：单有机物生物合成、单有机物生物代谢、氨基酸生物合成、小分子代谢、α氨基酸生物合成、含氧酸代谢、有机酸代谢、氨基酸代谢、α氨基酸代谢、有机化合物代谢。贮藏6 d时含氧酸代谢过程和有机酸代谢过程减弱，含碱基小分子代谢过程和羧酸代谢过程相关蛋白质显著富集。

ETH处理后贮藏3 d，含碱基小分子代谢过程、核苷酸代谢过程、磷酸核苷酸代谢过程、磷酸核糖代谢过程、核糖核苷酸代谢过程、小分子代谢过程和有机磷代谢过程相关蛋白质显著富集。贮藏6 d时，蛋白质折叠、分子伴侣介导的蛋白质折叠辅因子和羧酸代谢过程相关蛋白质显著富集。

1-MCP处理后贮藏3 d，乙醛酸循环体组织过程、有机磷代谢过程、羧酸代谢过程、单有机物生物降解过程、镉离子响应过程、核糖核苷酸代谢过程、金属离子响应过程相关蛋白质显著富集。贮藏6 d时，核苷酸代谢过程、磷酸核苷酸代谢过程、含碱基小分子代谢过程、磷酸核糖代谢过程、核糖核苷酸代谢过程、有机氮类化合物生物合成过程、嘌呤核苷酸代谢过程相关蛋白质显著富集。

茭白采后贮藏3 d，差异表达蛋白质主要涉及叶绿体、质体、细胞器部分、细胞质部分和乙醛酸循环体。贮藏6 d时，乙醛酸循环体蛋白质减少，细胞质蛋白质显著增多。说明，核糖体仅存在于细胞质中，是真核细胞合成蛋白质的细胞器和蛋白质合成的场所，茭白采后常温贮藏期间糖类的合成减弱，而蛋白质合成增强。

ETH处理后贮藏3 d，线粒体蛋白质增多，贮藏6 d细胞质蛋白质增多。1-MCP处理后贮藏3 d，线粒体、细胞质、线粒体基质、细胞内细胞器、细胞内膜结合细胞器和膜结合细胞器的蛋白质显著增多，贮藏6 d的变化与对照基本一致。

茭白采后贮藏3d，差异表达蛋白质涉及的前-10类分子功能为：氢酶活性、辅助结合因子、催化活性、磷酸吡哆醛结合蛋白质、分子内氧化还原酶活性、酶活性、铜离子结合蛋白质、转移酶活性（转移含氮基团）、转移酶活性和Ⅳ_乙酰Y-谷氨酰磷酸还原酶活性。贮藏6 d，参与L-2-酮戊二酸转氨酶活性和氧化还原酶活性的相关功能蛋白质增多。

ETH处理后贮藏3 d，质子转运ATP合酶活性（旋转机制）、ATP酶活性和氢离子跨膜轉运的相关功能蛋白质增多。贮藏6 d，阴离子结合、氧化还原酶活性、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）结合、氧化还原酶活性（作用于CH-OH基团）、辅酶结合和离子结合的相关功能蛋白质显著增多。

1-MCP处理后贮藏3 d，4-氨基丁酸转氨酶活性、钴离子结合、过渡金属离子结合、转氨酶活性、L-2-酮戊二酸转氨酶活性、氧化还原酶活性和阴离子结合相关功能蛋白质显著增多。贮藏6 d，碳氧酶活性、碳碳裂解酶活性、3-异丙基苹果酸脱水酶活性和辅酶结合相关蛋白质显著增多。

茭白采后贮藏期间涉及多种细胞定位和功能性蛋白质，参与多类生物学过程，但主要集中在氨基酸、有机酸和小分子等合成与代谢方面，ETH和1-MCP处理抑制了部分生物学过程，同时诱导了其他生物学过程，如核酸代谢、蛋白质合成、有机酸代谢和金属离子响应等，这些代谢过程可能与茭白采后衰老有密切联系。

2.4.3 KEGG通路分析将筛选到的差异表达蛋白质进行KEGG通路分析，结果（表3）显示，与贮藏0d（CK0d）相比，CK3d的茭白代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2一酮酸代谢、精氨酸生物合成、a-N麻酸代谢、二羧酸代谢的相关蛋白质显著富集，CK6d的茭白光合作用中的碳固定、α亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱，丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代谢、缬氨酸一亮氨酸一异亮氨酸降解和磷酸戊糖途径的相关蛋白质显著富集。

ETH和1-MCP处理对茭白采后贮藏期间KEGG通路有明显的影响。与CK3d相比，ETH3d的α亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱，氧化磷酸化以及甘氨酸一丝氨酸一苏氨酸代谢相关蛋白质显著富集，ETH6d光合作用中的碳固定、α亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱，丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代谢、磷酸戊糖途径以及苯丙氨酸一酪氨酸一色氨酸生物合成代谢途径相关蛋白质显著富集。与CK3d相比，1-MCP3d光合作用中的碳固定、精氨酸生物合成和α亚麻酸代谢途径减弱，三羧酸循环、丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代谢、缬氨酸一亮氨酸一异亮氨酸降解途径相关蛋白质显著富集，1-MCP6d光合作用中的碳固定、精氨酸生物合成、α亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱，磷酸戊糖途径、c5支链二元酸代谢、缬氨酸一亮氨酸一异亮氨酸降解、丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代谢途径相关蛋白质显著富集。ETH和1-MCP处理诱导了茭白采后贮藏期间KEGG通路的改变，这些通路可能与ETH和1一MCP调控茭白采后衰老有密切联系。

3讨论

iTRAQ技术是一种新型定量蛋白质组学分析技术，目前已成功应用于动物、植物和微生物等多种生物样品的比较蛋白质组学研究中。本研究共鉴定出1 908个可信蛋白质，数量远高于Wu等采用传统双向电泳技术分析桃果实线粒体得到的蛋白质数量（约350个），为茭白采后衰老生物学基础研究提供有益参考。

果蔬采后衰老是由多种因素引发和诱导的一系列生物学过程协同作用共同完成的结果。ETH和1一MCP可有效调控果蔬采后衰老，其作用的发挥需要通过调控蛋白质来完成。呼吸代谢、糖代谢、能量代谢、活性氧代谢、激素代谢等生物学过程与果蔬采后衰老密切相关，糖酵解减弱而磷酸戊糖途径增强是植物组织衰老过程中的一种普遍现象。本试验中，CK3d和CK6d共有13条途径相关蛋白质显著富集，表明这些生物学过程可能与茭白采后衰老相关。ETH6d的苯丙氨酸一酪氨酸一色氨酸生物合成途径相关蛋白质显著富集，该途径是木质素和酚类次生代谢产物合成的关键步骤，其显著富集结果与前人研究结果一致。1-MCP3d的三羧酸循环、丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代谢、缬氨酸一亮氨酸一异亮氨酸降解途径相关蛋白质显著增多，1-McP6d的磷酸戊糖途径和c5支链二元酸代谢途径相关蛋白质显著富集，表明1-MCP处理延缓衰老可能与调控三羧酸循环、磷酸戊糖途径和相关氨基酸降解途径有关，与应用传统双向电泳技术研究完整和鲜切茭白常温贮藏期间的比较蛋白质组学的结果…一致。

生物信息学分析结果表明，代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2一酮酸代谢、精氨酸生物合成、α亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径可能与茭白采后衰老有关。ETH和1一MCP处理对这些通路有明显的调控作用，三羧酸循环、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、c5支链酸代谢及相关氨基酸代谢途径可能在茭白采后衰老中发挥重要作用。然而，以上生物学过程与茭白采后衰老的确切关系仍未明确，相关差异表达蛋白质的生物学功能及其相互作用还有待进一步研究。