池俊玲 赵一博 郭江波 张龙 刘汉阳 辛翠花

摘要：【目的】篩选出镉（Cd）胁迫下烟草的最佳内参基因，为后续研究与Cd2+相关的功能性基因提供理论依据。【方法】分别以0、250和500 mg/L氯化镉（CdCl2）溶液对本生烟草进行胁迫处理，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同浓度Cd2+胁迫处理下肌动蛋白基因（ACT）、微管蛋白基因（TUB）、蛋白磷酸酶2基因（PP2A）、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）及转录延伸因子基因（EF1a）6个候选内参基因的表达情况，并利用geNorm和NormFinder综合评价Ct各内参基因表达的稳定性。【结果】以不同浓度Cd2+胁迫处理的本生烟草cDNA为模板均可PCR扩增出ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a等6个内参基因。6个内参基因的qRT-PCR扩增曲线走势正常，平行性好，无引物二聚体和非特异性条带产生，且绘制的标准曲线上各点基本分布在一条直线上，扩增效率在要求范围（90.00%～105.00%）之内，符合下一步评价要求，且斜率的回归系数（R²）>0.9800，说明线性关系较好。GAPDH和EF1a基因的表达丰度较高，18S rRNA处于中等水平，ACT、TUB和PP2A基因的表达丰度较低。geNorm分析结果显示，6个内参基因的表达稳定性排序为EF1a基因>GAPDH基因>ACT基因>TUB基因>PP2A基因>18S rRNA;NormFinder分析结果显示，6个内参基因的表达稳定性排序为EF1a基因>TUB基因>GAPDH基因=PP2A基因>ACT基因>18S rRNA。【结论】EF1a基因在不同浓度Cd2+胁迫处理下表达水平较高，稳定性最好，可作为Cd胁迫下本生烟草的最佳内参基因。

关键词： 烟草;镉胁迫;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）;内参基因;筛选

中图分类号： S572                                            文献标志码： A

文章编号：2095-1191（2019）10-2133-08      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of internal reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR under different concentrations of

Cd2+ stress in tobacco

CHI Jun-ling， ZHAO Yi-bo， GUO Jiang-bo， ZHANG Long，

LIU Han-yang， XIN Cui-hua*

（School of Life Science and Technology， Inner Mongolia University of Science and Technology，

Baotou， Inner Mongolia  014010， China）

Abstract：【Objective】The optimal reference genes for tobacco under cadmium（Cd） stress were screened，which laid the foundation for the subsequent study of functional genes related to heavy metal Cd2+. 【Method】The tobacco was treated with 0， 250 and 500 mg/L cadmium chloride（CdCl2） solution， and real-time quantitative PCR were used to detect the expression levels of six commonly used internal reference genes， including actin（ACT），tubulin（TUB）， protein phosphatase 2（PP2A），18S rRNA，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH） and elongation factor 1-ɑ（EF1a）， under different concentrations of Cd2+ stress. And the stability of expression of these internal reference genes were evaluated by the geNorm and NormFinder. 【Result】Six internal reference genes of ACT， TUB， 18S rRNA， PP2A， GAPDH and EF1a could be amplified by PCR using the tobacco cDNA treated with different concentrations of Cd2+ stress. The qRT-PCR amplification curves of the six internal reference genes showed normal trend， geed parallelism， no primer dimer and non-specfic bands， and the points on the standard curve were basically distributed on a straight line. The amplification efficiency was within the required range（90.00%-105.00%）， it met the requirements of the next evaluation， and the slope regression coefficient R2>0.9800， indicating a good linear relationship. The expression abundances of GAPDH and EF1a were high and more stable，18S rRNA was in the middle，and the expression  abundances of ACT，TUB and PP2A were low. The expression stability of EF1a was the highest in the geNorm program under different concentrations of Cd2+ stress，followed by GAPDH，TUB，PP2A，ACT and 18SrRNA. The NormFinder analysis showed that the expression stability rank was EF1a>TUB>GAPDH=PP2A>ACT>18S rRNA. 【Conclusion】EF1a has higher expression under diffe-rent concentrations of Cd2+ stress， and is the most stable one. It can be used as the optimal reference gene for tobacco under different concentrations of Cd stress.

Key words： tobacco; cadmium stress; real-time fluorescent quantitation PCR（qRT-PCR）; reference gene; selection

0 引言

【研究意义】镉（Cd）是生物体非必需且毒性很强的重金属元素，可导致植物发生一系列生理生化病变使其新陈代谢紊乱，严重时出现死亡症状（Andresen and Kupper，2013;Hui et al.，2015）。烟草（Nicotiana benthamiana）作为一种模式植物，因其生长周期短、个体小，常被用于研究基因功能。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）因具有特异性强、灵敏度高和实时检测等优点，是研究基因功能的有效手段（Maurin，2012），但其检测结果的精确性和可靠性常受RNA提取纯化质量、扩增效率及内参基因等因素的影响（Li et al.，2015，Ma et al.，2016）。选择以适宜内参基因以控制样品间的非特异性变异，是有效准确进行基因表达量标准化处理的前提（Lee et al.，2010）。因此，检测不同浓度Cd2+胁迫下烟草不同内参基因的表达情况，筛选出烟草在Cd胁迫下的最佳内参基因，对后续研究Cd2+相关的功能性基因具有重要意义。【前人研究进展】目前，植物功能性基因研究中常用的内参基因包括肌动蛋白基因（ACT）、微管蛋白基因（TUB）、蛋白磷酸酶2基因（PP2A）、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）和转录延伸因子基因（EF1a）等（Niu et al.，2015）。Nicot等（2005）对马铃薯在不同生理环境下内参基因表达稳定性进行比较分析，结果发现，在生物胁迫下EF1a和18S rRNA序列表达较稳定，盐胁迫下CYP和EF1a基因表达较稳定，低温胁迫下EF1a和L2基因表达较稳定。Wang等（2014）筛选非生物胁迫下油菜的最佳内参基因，结果发现盐胁迫和干旱胁迫下PP2A基因是最佳内参基因，而重金属Cr6+胁迫下ACT7基因是最佳内参基因。崔菲菲等（2018）研究发现，大白菜—结球甘蓝易位体系在不同发育时期、组织部位及激素处理下的最适内参基因各不相同：UKN1和TUB4基因是营养生长期的最佳内参基因;BcT1P41和ACTIN基因是包心期经生长素IAA处理下的最佳内参基因，但UKN1和BcTIP41基因是生长素抑制剂TIBA处理下的最佳内参基因。潘虹等（2019）对不同光质培养的刺葡萄红色愈伤组织功能性基因的表达进行qRT-PCR检测时，分别以a-Tubulin、AP-2、60SRP、EF1a和UBQ基因为候选内参基因，利用geNorm、Normfinder和BestKeeper对其表达稳定性进行分析比较，最终确定a-Tubulin和60SRP基因为最佳内参基因。张颖等（2019）研究发现，ACT和EF1a基因可作为杉木不同组织中功能性基因表达的qRT-PCR最佳内参基因。【本研究切入点】目前，鲜见有关不同浓度Cd2+胁迫下烟草qRT-PCR内参基因筛选的研究报道。【拟解决的关键问题】研究不同浓度Cd2+胁迫下本生烟草中ACT、TUB、PP2A、18S rRNA、GAPDH和EF1a等6个候选内参基因的表达情况，并利用GeNorm和NormFinder对其表达稳定性进行综合评价，最终筛选出最佳内参基因，为后续研究与Cd2+相关的功能性基因提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

本生烟草和大肠杆菌（Escherichia coli）DB3.1均由内蒙古科技大学生命科学与技术学院实验室保存提供。TRIzol试剂、2×Taq PCR Master Mix、pGM-T载体、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;SYBR®Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）購自TaKaRa公司;限制性内切酶EcoR I购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。主要仪器设备：梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司）、高速冷冻离心机（Thermo SCIENTIFIC公司）、电热恒温培养箱（上海—恒科学仪器有限公司）和ABI 7500实时荧光定量PCR仪（Thermo SCIENTIFIC公司）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 材料种植及Cd2+胁迫处理 将本生烟草种植于有机土与蛭石等体积混合的花盆中，置于温室中培养。待烟草植株长出4片真叶时，分别用0（对照）、250和500 mg/L氯化镉（CdCl2）溶液浇灌烟草，每周浇灌2次，每次150 mL，2周后分别采集各处理植株叶片0.1 g，用于RNA提取。

1. 2. 2 总RNA提取及cDNA合成 分别将不同浓度Cd2+协迫处理的本生烟草叶片置于预冷研钵中，用液氮研磨至粉末状，按照TRIzol试剂说明提取RNA，用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计测定其浓度，并用变性琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性。以提取的RNA为模板，利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix试剂盒反转录合成cDNA第一链，稀释5倍后-20 ℃保存备用。

1. 2. 3 引物设计 根据NCBI数据库中本生烟草基因组信息，选取ACT、TUB、PP2A、18S rRNA、GAPDH和EF1a6基因为候选内参基因，利用Primer 5.0设计其qRT-PCR扩增引物（表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 2. 4 内参基因PCR扩增 以不同浓度Cd2+协迫处理的本生烟草叶片cDNA为模板，用6个内参基因引物进行PCR扩增，反应体系50.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各4.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 2. 5 重组载体构建 参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明切胶回收内参基因目的片段，连接至pGM-T载体上，采用热激法将其转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，经菌落PCR筛选出阳性克隆，提取其质粒，利用EcoR I限制性内切酶对其进行酶切验证。酶切验证为阳性的克隆接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃下180 r/min摇床过夜培养后送上海捷瑞生物工程有限公司测序。

1. 2. 6 内参基因qRT-PCR检测 分别以不同浓度Cd2+处理的本生烟草叶片cDNA为模板对6个候选内参基因进行qRT-PCR检测，每处理的cDNA模板设3个生物学重复。反应体系20.0 μL：2×SYBR®Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，进行40个循环。PCR反应结束后仪器自动读取数据。

1. 3 统计分析

使用Excel 2013对内参基因不同稀释梯度下的循环阈值（Ct）进行整理，计算Ct均值，绘制标准曲线。再利用2-△△Ct法计算不同浓度Cd2+胁迫下候选基因的相对表达量。根据6个内参基因在各样品中的相对表达量，分别以geNorm和NormFinder对其表达稳定性进行分析比较，综合测评筛选出最佳内参基因。

2 结果与分析

2. 1 总RNA提取及质量检测结果

利用TRIzol法提取不同浓度Cd2+胁迫处理的本生烟草叶片总RNA，电泳检测结果（图1）显示，28S rRNA条带亮度约是18S rRNA条带亮度的2倍，条带清晰，说明总RNA样品的完整性较好。核酸定量仪检测结果（表2）显示，总RNA样品A260/A280约2.00，A260/A230>2.00，平均浓度为1893.3 ng/μL，表明不同浓度Cd2+胁迫处理的本生烟草总RNA提取质量和纯度较高，可用于后续试验。

2. 2 内参基因PCR扩增结果

对不同浓度Cd2+胁迫处理的本生烟草cDNA进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，从不同浓度Cd2+胁迫处理的本生烟草cDNA均扩增出目标片段，且扩增出的ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a内参基因长度与预期结果基本一致，且特异性较高。图2为以250 mg/L Cd2+胁迫处理本生烟草cDNA为模板的扩增结果。

2. 3 重组质粒的酶切验证结果

ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a 6个内参基因重组质粒酶切鉴定结果如图3所示，均获得2条条带，且条带大小与预期结果一致，表明6个内参基因片段已成功连接至pGM-T载体中。

2. 4 内参基因的qRT-PCR检测结果

2. 4. 1 内参基因扩增曲线和熔解曲线分析结果

将含内参基因的重组质粒10倍梯度稀释（10-1～10-9）后进行qRT-PCR检测，结果如图4所示。内参基因扩增曲线走势正常，平行性好;55～95 ℃熔解曲线仅出现明显单一峰，表明无引物二聚体和非特异性条带产生，所用引物均能特异扩增。

2. 4. 2 内参基因的标准曲线 以重组质粒10-1～10-9稀释梯度的对数（起始数量的对数）为x轴、Ct为y轴绘制6种内参基因的标准曲线（图5），并计算扩增效率E（%）=（10-1/斜率-1）×100，结果如表5所示。内参基因ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a的模板浓度与Ct成反比，各点基本分布在一条直线上，扩增效率在要求范围（90.00%～105.00%）之内，符合下一步评价的要求，且标准曲线斜率的回归系数（R²）>0.9800，说明线性关系较好。

2. 4. 3 内参基因的表达丰度分析结果 基因表达丰度是指基因转录成mRNA的数量，基因表达丰度越高，转录mRNA的数量愈多，合成的蛋白也越多。Ct越大，代表基因拷贝数越低，基因表达丰度越低。由图6可知，6个内参基因在0、250和500 mg/L Cd2+胁迫下的表达水平均存在明显差异，整体来说，处理组（250和500 mg/L Cd2+胁迫）与对照组（0 mg/L Cd2+胁迫）存在显著差异（P<0.05）或极显著差异（P<0.01），说明Cd2+胁迫处理对内参基因的表达具有显著或极显著影响，以保证后续数据可靠有效，其中，ACT、TUB和PP2A基因的表达丰度较低，18S rRNA处于中等水平，而GAPDH和EF1a基因的表达丰度较高，说明GAPDH和EF1a基因適宜作为不同浓度Cd2+胁迫下本生烟草的内参基因。

2. 4. 4 内参基因的表达稳定性分析 利用geNorm程序计算6个内参基因在不同浓度Cd2+胁迫下的表达稳定值（M），结果如图7所示。6个内参基因的M排序为18S rRNA（1.708）>PP2A基因（1.428）>TUB基因（1.368）>ACT基因（1.240）>GAPDH基因（1.228）>EF1a基因（1.140），由于M越低内参基因表达越稳定，故EF1a基因表达最稳定，最适宜作为在不同浓度Cd2+胁迫下本生烟草的内参基因，其次是GAPDH和TUB基因，而18S rRNA表达最不稳定，最不适合作为内参基因。利用NormFinder程序计算内参基因在不同浓度Cd2+胁迫下的表达稳定值（S），结果如表6所示。6个内参基因的S排序为18S rRNA（1.106）>ACT基因（0.825）>GAPDH基因=PP2A基因（0.696）>TUB基因（0.472）>EF1a基因（0.411），由于S越低，基因表达越稳定，故EF1a基因表达最稳定，最适宜作不同浓度Cd2+胁迫下本生烟草的内参基因，而18S rRNA表达最不稳定，最不适合作为内参基因，与geNorm程序分析结果一致。

3 討论

qRT-PCR是检测基因表达变化的最佳方法之一（Bustin et al.，2005）。在分析功能性基因表达之前，必须选择适宜内参基因以控制样品之间的非特异性变异。在不同生物和生理状态下稳定表达的内参基因才可有效用于表达量的标准化（Lee et al.，2010）。理论上，理想的内参基因应在所有细胞和组织形态及不同试验条件下均能稳定表达且不受外界环境影响（Tong et al.，2009），但目前尚未发现一个这样理想的内参基因。已有研究表明，即使内参基因在一种物种或组织中稳定表达，但在不同试验条件下也会表现出不同的稳定性（Guénin et al.，2009;Artico et al.，2010）。因此，在分析功能性基因表达之前，必须事先验证所有内参基因，确定其在某些条件下的表达稳定性，以保证试验结果的准确性（Bustin，2002;Gutierrez et al.，2008;Guénin et al.，2009）。

本研究选取植物功能性基因研究中常用的6个内参基因，利用geNorm和NormFinder分析其表达稳定性，从而筛选出不同浓度Cd2+胁迫下本生烟草的最佳内参基因。其中，geNorm是确定稳定内参基准的最佳数量以精确标准化的简便方法（Vandesompele et al.，2002），而NormFinder用于评估geNorm获得的排名质量（Andersen et al.，2004;Pfaffl et al.，2004）。本研究根据qRT-PCR的Ct进行内参基因表达丰度分析，结果显示ACT、TUB和PP2A基因的表达丰度较低，18S rRNA处于中等水平，GAPDH和EF1a基因的表达丰度较高，可初步确定GAPDH和EF1a基因可作为Cd2+胁迫下本生烟草的内参基因。经geNorm和NormFinder对其稳定性进行分析后发现EF1a基因表达稳定性最好，因此，EF1a基因是不同浓度Cd2+胁迫下本生烟草的最佳内参基因。

4 结论

EF1a基因在不同浓度Cd2+胁迫处理下表达水平较高，稳定性最好，可作为Cd胁迫下本生烟草的最佳内参基因。

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（責任编辑 陈 燕）