初步探究六味地黄丸对小鼠焦虑行为的影响

2019-09-10宾有富李佳恒刘苑犇韦武涛黄群梁明坤钟静

健康前沿 2019年2期

宾有富李佳恒刘苑犇韦武涛黄群梁明坤钟静

摘要：目的：初步探究六味地黄丸对小鼠焦虑行为的影响。方法：将小鼠随机分为6组，采用不可预知情绪应激法连续造模7日后，使用不同手段进行为期7日的干预治疗；采用高架十字迷宫实验测试小鼠焦虑行为变化以及六味地黄丸的作用影响。结果：造模后，与空白组比较，焦虑模型组OE%、OT%、探头次数、探头总时间减少，提示焦虑造模成功；末次给药后，与末次给药前比较，阳性对照组、六味地黄丸高、中、低剂量四组的OE%、OT%、探头总时间、探头次数增加（P<0.05）。结论：六味地黄丸具有改善小鼠焦虑行为作用。

关键词：六味地黄丸小鼠焦虑行为改变

焦虑性神经症（Anxiety Neurosis）简称焦虑症，现代医学将其分为广泛性焦虑和急性焦虑，主要表现为莫名紧张或惊恐等神经障碍[1]。孙秀丽等[2]的研究报告表明，河北4个地区广泛性焦虑的城市患病率为4.87‰，农村患病率为8.10‰；女性患病率10.42‰，高于男性4.97‰，男女比例为1：2.1；焦虑症是临床上的常见病，它已经严重的影响了患者的生活质量。现代医学治疗焦虑多以药物为主，治疗效果各有差异。中医古代文献未详细记载有焦虑症的病名，但综合古代医家描述，焦虑症中医症属情志病范畴，病人时常表现担忧，紧张或恐惧等症状[2]，肾阴虚亏为主要病机，故中医使用六味地黄丸补肾滋阴以安神定志，缓解焦虑症状的发生。六味地黄丸主要记载于宋代医学家钱乙的《小儿药证直诀》，是补髓滋肾的经典方。后由汉代医学家张仲景在《金匮要略》提出，减去桂枝、附子等偏于补阳的药物，替换干地黄为熟地黄而成[3]。本实验主要是初步探究六味地黄丸对肾亏阴虚型小鼠焦虑行为的影响，为临床用药提供依据。

1 实验材料

1.1实验动物雄性昆明种小鼠36只，SPF 级，周龄8-12周岁，体质量（28.43 ±1.94g）。购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 实验制剂六味地黄丸（农本方颗粒），制造商为培力香港集团附属培力（南宁）药业有限公司。药物组成：熟地黄、山萸肉、干山药、泽泻、牡丹皮、茯苓。在进行首次给药前，用蒸馏水作为溶剂配置成相应浓度，配置好后放入4℃冰箱进行保存。地西泮片1.5 mg/片，购置于济宁市安康制药有限责任有限公司；蒸馏水，购置于东莞市纳百川水处理设备有限公司。

1.3 实验器材高架十字迷宫装置（the elevated plus-maze，EPM），购置于南宁市辰泽实验科技有限公司。主要组成：两个相对的开放臂（open arm，内径：长×宽×高）：30cm × 5cm × 15cm；两个相对的封闭臂（enclosedarm，内径：长×宽×高）：30cm × 5cm × 0.5cm；迷宫中心是一个由开放臂和封闭臂交汇而成正方形平台（centre platform，内径，长×宽）：5cm × 5cm。两个封闭臂的顶部呈敞开状态，四个实验臂的内侧壁为黑色背景，整个装置放于铁质的十字支架上，使高架十字迷宫整体的下缘平面距离地面50cm。

2 实验方法

2.1实验分组

36只小鼠常规喂养7d适应环境后，按照随机分组的原则将小鼠分成6组，每组6只，分别为空白对照组，焦虑模型对照组，阳性地西泮对照组，六味地黄丸高剂量组、六味地黄丸中剂量组、六味地黄丸低剂量组。实验前，各组别小鼠体质量、小鼠肛温、OE%、OT%、探头次数、探头总时间比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

2.2 实验造模和给药

本实验的造模方式参照焦虑造模的相关文献[4-7]，并作相应改变。主要采用不可预知的情绪应激法来进行为期7d的焦虑造模[8]。主要包括噪音应激实验、禁水、禁食、24h光照、24h黑暗、潮湿垫料（质量比：垫料：水=1：2）、倾斜等7种应激刺激。每天随机采取一种刺激，连续7日。造模结束后，对各组别小鼠进行不同手段的治疗措施干预，治疗期间，小鼠正常喂食饲养。按照等效量换算法计算。把成年人每日需要的生药量折算为小鼠所需生药量。方法如下，成人每日用量为63g，小鼠所需生药量为63*0.018*5=5.7g/Kg（0.018是根据中药药理学实验方法中人与小鼠体表面积的转换系数，于是将30g小鼠所需生药量换算成Kg后，即小鼠所需的生药量）。治疗期间，空白对照组、焦虑模型组给予蒸馏水（20ml·kg-1·d-1）进行治疗干预，六味地黄丸按高（1.35g·kg-1·d-1）、中（0.45g·kg-1·d-1）、低（0.15g·kg-1·d-1）三个剂量进行治疗干预，阳性地西泮对照组给予地西泮溶液（0.0003g·kg-1·d-1）进行治疗干预，每天1次，于治疗期每天上午8：30进行，持续7日，实验的总时间长为14日。

2.3 评定的指标与方法

本實验采用高架十字迷宫测试来测定小鼠的行为变化。主要测试时间为造模前（第1天），首次给药前（第8天），末次给药后次日（第15天）的8∶00～12∶00AM，测试实验在安静环境中进行。测试前先将小鼠置于开场中活动5 min，然后把小鼠放在迷宫的中间，并把它的头部朝向开放臂。用迷宫上方的摄像头录制小鼠在迷宫内的活动情况，录制时间为5 min。每只小鼠放置迷宫测试行为前，需用配置好的84消毒液与75%酒精进行擦拭与清洁，消除前1只小鼠的留下的气味和排泄物。计算好小鼠开放臂进入次数百分比（OE%）即开放臂进入次数/（开放臂进入次数 + 封闭臂进入次数）和开放臂停留时间百分比（OT%）即开放臂停留时间/（开放臂停留时间 + 封闭臂停留时间）[9]，比值大则较少出现焦虑行为，其中出现探头次数也可以理解为小鼠有探索欲望，探头次数或探头总时间增多也可认为焦虑行为有改善。体质量变化=实验后-实验前；体温（肛温）=实验后-实验前。

2.4统计学方法

所有实验数据运用Microsoft Excel及SPSS20.0forWindows软件进行处理，结果以平均数x±s表示，数据进行组间单因素方差分析。P<0.05为有统计学意义。

3.实验结果

造模结束后，与造模前相比，除空白组外，焦虑模型组等五个组别的小鼠OE%及OT%显著减少，探头总时间及探头次数也显著减少（P<0.05），提示小鼠已经进入了焦虑的状态。给药结束后，与模型组相比，六味地黄丸高、中、低剂量组别的OE%、OT%、探头总时间、探头次数显著增加（P<0.05），与阳性对照组相近，表示对小鼠焦虑行为有改善作用。实验结束后，小鼠的体重，肛温均值总体增加。如图1，图2，图3所示。

4.讨论

造模结束后，除空白组外，其余造模的五个组别的小鼠进入开放臂次数和探头次数明显减少，说明随机使用倾斜、噪音、黑暗24h、光照24h、无垫料、禁水、禁食等方法焦虑造模成功。与焦虑模型组比较，阳性地西泮对照组能显著增加小鼠探头总时间和探头次数（P﹤0.05），表现出有抗焦虑作用。实验表明，六味地黄丸对小鼠的焦虑行为有一定的改善作用，但具体的生理机制还需要进一步的探究。六味地黄丸以熟地黄为君药，熟地黄入肝肾经，具有滋补阴血，益精填髓的功效；山茱萸涩精固脱，山药并补肾脾[10]。茯苓、泽泻、牡丹皮合为“三泻”，平秘而补脾胃。六药合用，使六味地黄丸具有填精益髓，滋养肝肾的功效。但六味地黄丸的作用不仅仅局限于此，它的使用范围可进一步的扩大。本次实验只是初步探究了六位地黄丸对焦虑行为的影响作用，其主要的作用机制还需进一步的探究，因此，深入研究六味地黄丸对小鼠焦虑行为的作用机制及将它应用于临床，对进一步发展中医药的事业有巨大的意义。

参考文献：

[1]张心保主编 .神经精神病学 .北京：科学技术出版社，1980：87.

[2]孙秀丽，栗克清，崔利军，等.河北省 4 个地区广泛焦虑症的流行病学调查[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（39）：7842-7844.

[3]崔瑛，冯静，王世宏，申秀丽. 焦虑症的中医用药及组方规律探讨[J]. 中国临床康复，2004（18）：3630-3631.

[4]王萍，王喜军.六味地黄丸研究现状[J].中医药信息，2013，30（3）：163 -165.

[5]周奇志，赵纪岚，蔡定钧，等.电针对慢性情绪应激焦虑大鼠中枢单胺递质与γ-氨基丁酸失平衡的调节作用[J].中华中医药杂志，2008，23（10）：926.

[6]徐海洋，周奇志，王薇，等.电针对慢性情绪应激焦虑模型大鼠行为学影响的研究[J].四川中医，2007，25.

[7]孙君辉，凌沛学，蒋秋燕，等.焦虑大鼠模型的应用及研究进展[J].食品与药品，2011，13（11）：438.

[8]周宁娜，何晓山，曹东，等.解虑安神汤对社会隔离焦虑小鼠行为学及脑内ALLO水平的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（13）：185.

[9]闫清伟，田青. 3种干预方法对焦虑大鼠高架十字迷宫行为的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（19）：225-228.

[10]王萍，王喜军. 六味地黄丸研究现状[J]. 中医药信息，2013，30（03）：163-165.

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