谢冬娣 覃丽丹 等

摘要：【目的】探討乳链菌肽对荸荠贮藏期间腐烂病和品质的影响，为实际生产中延长荸荠贮藏期提供技术支持。【方法】以0.03%乳链菌肽分别浸泡洗净和带泥的采后荸荠5 min为试验处理（T1和T2），以不经乳链菌肽处理的洗净和带泥荸荠为对照（CK1和CK2），均置于温度（6±1）℃、湿度40%～60%的冷库条件下贮藏，测定贮藏期间荸荠的菌落总数、烂果率、可溶性固形物（TSS）含量、丙二醛（MDA）含量及过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性等指标。【结果】带泥或洗净的荸荠经乳链菌肽处理，可减缓菌落总数和烂果率上升，防止贮藏期间荸荠的腐烂病发生，有效延缓荸荠TSS含量下降和MDA含量积累，抑制POD、SOD和PAL活性的快速上升;其中，乳链菌肽处理洗净的荸荠贮藏至第100 d时仍能保持较好品质，分别与CK1和CK2相比，其菌落总数明显减少36.84%和29.41%，烂果率降低77.09%和79.29%，TSS含量上升75.00%和69.00%，MDA含量下降34.59%和33.81%，POD活性降低17.14%和20.87%，SOD活性升高45.68%和71.61%，PAL活性下降25.17%和28.93%。【结论】乳链菌肽可抑制荸荠贮藏期腐烂病发生和品质下降，从而延长荸荠的贮藏期。

关键词： 荸荠;乳链菌肽;腐烂病;贮藏品质

中图分类号： S645.3                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0378-07

Abstract：【Objective】Effect of nisin on corm rot and quality of water chestnut during storage were investigated in order to provide technical support for prolonging the storage period of water chestnuts. 【Method】Postharvest water chestnuts were used as materials. Stored under cold temperature（6±1）℃ and humidity 40%-60%， washing or muddy water chestnut with soaking 0.03% nisin for 5 min were set as treatments（T1 and T2）， and washing or muddy water chestnuts without nisin treatment were controls（CK1 and CK2）. The total plate count，rotted rate，total soluble solids（TSS） content，malondialdehyde（MDA） content，peroxidase（POD） activity，superoxide dismutase（SOD） activity and phenylalanine ammonia lyase（PAL） activity of water chestnut were investigated during the trial period. 【Result】The results showed that for muddy or washed water chestnut， nisin treatment could  slow down the increase of total plate counts and rotted rate，and prevented the rot of water chestnut during storage，delayed the decline of TSS content and accumulation of MDA content，and inhibited the rapid increase of activities of POD，SOD and PAL. Among them，nisin treated washed water chestnuts still had good quality on day 100 of storage. Compared with CK1 and CK2，total plate counts reduced by 36.84% and 29.41%，rotted rates reduced by 77.09% and 79.29%，TSS contents increased by 75.00% and 69.00%， MDA contents reduced by 34.59% and 33.81%，POD activities reduced by 17.14% and 20.87%，SOD activities increased by 45.68% and 71.61% and PAL activities reduced by 25.17% and 28.93% respectively. 【Conclusion】The occurrence of rot disease and the decline of quality during the storage period of water chestnut are inhibited by nisin，thus extending the storage life of water chestnut.

Key words： Eieocharis tuberose Sehult; nisin; corm rot; storage quality

0 引言

【研究意义】荸荠（Eleocharis tuberose Sehult）又名马蹄、地栗、水栗、乌芋等，为莎草科荸荠属（Eleocharis R. Br.）多年生浅水草本植物，以地下球茎为食，在我国已有2000多年栽培历史，因其具有抗氧化、抗菌、抗癌及治疗呼吸道和糖尿病等保健作用而享有“江南人参”之美誉（谈如蓝和孙海军，2016）。广西是全国最大的荸荠种植区域，占全国荸荠种植面积的60%左右，2015年广西种植面积超2万ha，年产量114万t（康超等，2017）。品种多以皮薄汁多的水果荸荠为主，以鲜果或经加工销往沿海各省及东南亚各国，甚至远销欧美市场，但其采收后易失水皱缩，腐烂变质，产地鲜销的货架期不超过10 d，存在较大市场风险。产地农户常采用传统的泥藏、窖藏、罐藏、次氯酸钠液藏等方法进行贮藏，但这些方法受环境变化影响大，温湿度条件难以控制，贮藏效果不理想（石庆芬，2014）;不少种植户也采用留田延时采挖方法以缓解销售压力，但成熟的荸荠搁在田里过久会变质变黑，易腐烂，非常不利于快速上市，同时有延误农耕时机的风险。因此，解决荸荠的季产年销问题势必需要有效的贮藏技术，从而提高农民种植荸荠的积极性，促进我国荸荠产业的良性发展。【前人研究进展】随现代食品加工保藏技术的发展，荸荠的贮藏保鲜研究也在不断改进。邓丽莉等（2010）以乙醛对采后荸荠熏蒸处理4 h，结果发现0.1%和0.5%乙醛熏蒸处理延缓鲜切荸荠褐变的效果最佳，但同时会加速还原性维生素C的降解;尹璐等（2013）采用可食性材料的涂膜保鲜荸荠，结果发现壳聚糖—葛根淀粉复合膜处理鲜切荸荠可延缓其品质下降;田维娜等（2015）研究热处理对荸荠切片色泽及品质的影响，结果表明，轻微的热处理（58 ℃、20 min），可有效抑制切片褐变度的增加，较好地保持切片品质;邓靖等（2016）探索新型抗菌剂（碱式次氯酸镁）对鲜切荸荠的护色保鲜效果，结果表明，独立小包装碱式次氯酸镁为4 g时，可减弱鲜切荸荠的黄化程度。以上研究均是从生产企业加工鲜切荸荠方面展开，在操作工艺的繁琐程度及控制条件的精准度上存在种植户较难掌握的局限性。目前，对整果荸荠的研究主要从抑制贮藏期间腐烂病方面展开，而较少关注贮藏期荸荠品质变化，如廖旺姣等（2009）采用抑菌圈法对荸荠腐烂病药剂进行筛选研究，发现棘孢木霉是引起荸荠贮藏期球茎腐烂病的主要病原菌，50%噻菌灵+25.5%异菌脲防治荸荠球茎腐烂病效果最佳;赖传雅等（2013）研究发现，贮藏期荸荠球茎腐烂病是由多种病原菌（包括细菌和真菌）所致，贮藏期温度决定优势病原菌种类。上述二者主要研究荸荠表面真菌微生物状况，但未观察荸荠在更低温度及更长贮藏期的品质变化情况。乳链菌肽又称尼生素（Nisin），能有效抑杀革兰氏阳性菌及经螯合剂处理、亚致死加热或冷藏处理的革兰氏阴性菌，尤其能抑制芽孢的生长（刘翀和杨洋，2005），目前广泛使用于多种食品的防腐保鲜。杨霞和王大平（2012）采用乳链菌肽溶液结合柠檬酸在低温下对鲜切莲藕进行处理，结果表明，0.5%柠檬酸和250 mg/kg乳链菌肽混合溶液保鲜效果最佳;孙文婷和王大平（2014）采用乳链菌肽处理苦瓜后进行低温贮藏，结果表明，乳链菌肽处理可有效抑制苦瓜腐烂率，延缓可溶性固形物（TSS）和可溶性蛋白质含量下降;谢冬娣等（2018）采用咪鲜胺结合乳链菌肽处理淮山后贮藏30 d，结果显示，淮山表面的微生物增长受到抑制。【本研究切入点】已有研究较少涉及带有顶芽、侧芽及鳞膜的整果荸荠在低于10 ℃下贮藏2个月以上，至今也未见单独应用乳链菌肽防治采后荸荠腐烂病并贮藏1个月以上的研究报道。【拟解决的关键问题】以芳林马蹄品种为试验材料，采用0.03%乳链菌肽浸泡处理洗净或带泥的荸荠，探讨在冷库（6±1）℃条件下贮蔵100 d的荸荠品质变化及腐烂病发生情况，以期为延长采后荸荠的贮藏期提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

荸荠品种芳林马蹄购自广西贺州市芳林三加村。主要试剂：乳链菌肽（效价>1000 IU/mg，浙江银象生物工程有限公司），愈创木酚（天津市多利精细化工有限公司），聚乙烯吡咯烷酮（PVP，成都市科龙化工试剂厂），三氯乙酸（TCA，上海麦克林生化科技有限公司），硫代巴比妥酸（TBA，上海谱振生物科技有限公司），巯基乙醇硼酸、苯丙氨酸、硼酸盐、氮蓝四唑（NBT）、核黄素[生工生物工程（上海）股份有限公司]。主要仪器设备：722N型可见光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、UV1901PC型紫外可见分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）、KH30R-11型高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、WAY-2WAJ型阿贝折光仪（上海申光仪器仪表有限公司）和实验室小型冷库。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验设计 选取大小、色泽、成熟度基本一致、无明显机械损伤、无病虫害的采挖24 h内荸荠，以0.03%乳链菌肽水溶液分别浸泡处理洗净和带泥的荸荠（清洗勿弄伤荸荠，带泥的需稍清理表面泥块）5 min，分别标记为T1和T2处理，稍晾干表面液体后用聚乙烯保鲜袋盛装，敞口5～10 cm直径，置于温度（6±1）℃、湿度40%～60%的冷库条件下贮藏;以不浸泡乳链菌肽的洗净（CK1）和带泥（CK2）荸荠为对照。每处理10 kg，设3个重复。贮藏观察期100 d，貯藏前（0 d）及贮藏期每20 d取一次样，测定荸荠的微生物指标（菌落总数）、烂果率及品质指标。

1. 2. 2 微生物指标测定 菌落总数参照食品安全国家标准GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定。

1. 2. 3 烂果率测定 荸荠表皮出现腐褐渍斑定为腐烂果，以每次测定烂果质量（W1）占最初荸荠总质量（W0）的百分比表示。烂果率（%）=W1/W0×100。

1. 2. 4 TSS含量测定 采用阿贝折光仪测定荸荠汁中的TSS含量。

1. 2. 5 丙二醛（MDA）含量测定 参考Liu等（2006）的双组分光光度法进行测定，略作修改。取5 g荸荠，加入8.00 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）和0.4 g PVP，冰浴研磨，于4 ℃下10000 r/min离心15 min。以4.00 mL为反应体系，取上清液1.00 mL，加入3.00 mL 0.5% TBA（溶于10% TCA）混匀，沸水显色15 min后快速冷却至室温，再4000 r/min离心15 min，以磷酸缓冲液为参比，测定上清液吸光值。

MDA含量=[6.45×（A532-A600）-0.56A450]×V/

（Vm×W）

式中，A532、A600和A450分别为样液在532、600和450 nm波长下的吸光值，V为上清液总体积（mL），Vm为测定时所取体积（mL），W为取样质量（g）。

1. 2. 6 过氧化物酶（POD）活性测定 参考胡瑞斌等（2014）的愈创木酚比色法进行测定，略作修改。称取5 g荸荠，加入8.00 mL磷酸缓冲液（pH 6.8），再加入0.4 g PVP，冰浴研磨，4 ℃下10000 r/min离心15 min提取上清液。以2.00 mL为反应体系，精确量取0.75 mL 50 mmol/L愈创木酚溶液、0.25 mL 2% H2O2和0.90 mL磷酸缓冲溶液（pH 6.8）于5 mL试管中，再加入0.10 mL酶液迅速混匀，测定3 min内470 nm的OD。以每分钟OD470变化0.001表示1个酶活单位。

1. 2. 7 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 参照曹建康等（2007）的NBT比色法进行测定，以1 h内将NBT的光还原抑制到对照的50%所需酶量定义为1个酶活单位。

1. 2. 8 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定 参考孙广宇和宗兆锋（2002）的紫外分光比色法进行测定，略作修改。称取5 g荸荠，加入5 mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液10.00 mL，再加入0.4 g PVP，冰浴研磨，4 ℃下10000 r/min离心15 min。以7.00 mL为反应体系，取4.00 mL 0.2 mol/L硼酸盐缓冲液（pH 8.8）、2.00 mL 20 mmol/L苯丙氨酸和1.00 mL酶液，37 ℃水浴1 h，测定290 nm的OD。以煮沸5 min的酶液为参比。以每分钟OD290变化0.001表示1个酶活单位。

1. 3 统计分析

采用Excel 2007整理数据，SPSS 19.0分析数据，并采用Duncan’s新复极差法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2. 1 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠菌落总数的影响

菌落总数在一定程度上标志农产品卫生质量的优劣，因此常作为判别农产品被污染程度的主要指标。由图1可知，在冷库条件下，各处理荸荠的菌落总数均随贮藏时间的延长而增加，前半期为积累期，后半期为暴发期。贮藏至第20 d时，各处理无显著差异（P>0.05，下同）;贮藏40～100 d，经乳链菌肽处理的洗净或带泥荸荠（T1和T2处理）的菌落总数均显著低于对照（CK1和CK2）（P<0.05，下同），说明乳链菌肽对采后荸荠表面微生物的生长繁殖具有抑制效果。两个对照荸荠贮藏至第60 d的菌落总数已超过5 lg（CFU/g），根据食品安全国家标准GB 4789.2—2016，此时荸荠已处于不适宜食用状态。在整个贮藏期，T1和T2处理间的菌落总数均无显著差异，但T1处理的菌落总数始终较少，贮藏至第100 d时仍低于5 lg（CFU/g）。究其原因可能是荸荠所带泥土的某些微生物对乳链菌肽不敏感。

2. 2 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠烂果率的影响

微生物损害果蔬的最普遍形式是腐烂。荸荠中含有糖类、果胶和维生素等丰富的营养物质，容易繁殖微生物，引起腐烂变质，并随贮藏期的延长而加剧腐烂程度（赖传雅等，2013）。由图2可知，在冷库条件下，各处理的荸荠烂果率均随贮藏时间的延长而增加。贮藏至第20 d时，CK1和CK2出现烂果，而T1和T2处理均未出现烂果;贮藏40～100 d，两个对照的荸荠烂果情况愈加严重，T1和T2处理的烂果始终较少，烂果率显著低于CK1和CK2，与T1和T2处理荸荠在贮藏40～100 d的菌落总数显著低于对照的结果相一致。贮藏80～100 d时，T1和T2处理间的烂果率差异显著，其中T1处理烂果率始终较低，贮藏至第100 d时烂果率仍控制在10.00%以下，仅为7.45%。说明乳链菌肽对采后荸荠烂果情况起到抑制作用。

2. 3 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠TSS含量的影响

TSS为果蔬中可溶于水的化合物总称，是果蔬品质的重要指标（刁俊明等，2015）。由图3可知，在冷库条件下，荸荠的TSS含量随贮藏时间的延长呈逐渐下降趋势，是因为荸荠在贮藏期间需消耗自身营养成分来满足生理活动进行呼吸作用。在贮藏期的前40 d，各处理荸荠的TSS含量均下降缓慢;在贮藏期60～100 d，CK1和CK2荸荠的TSS含量下降幅度增大，贮藏结束时，两组对照荸荠的TSS含量均下降至6.70%以下。在整个贮藏期，T1和T2处理荸荠的TSS含量变化相对缓慢，处理间无显著差异，其中T1处理荸荠的TSS含量贮藏至第100 d时仍保持在10.00%以上;在贮藏期60～100 d，T1处理与两个对照荸荠的TSS含量差异显著。可见，乳链菌肽处理荸荠可较好地维持其TSS含量。

2. 4 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠MDA含量的影响

MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量可反映果蔬遭受伤害的程度。由图4可知，在冷库条件下，荸荠的MDA含量随贮藏时间的延长总体上呈上升趋势。这是因为荸荠受成熟衰老和环境胁迫影响，在代谢过程中产生的某些自由基促使膜脂过氧化反应，导致MDA含量上升（杨曦等，2015）。在貯藏20 d后，各处理荸荠的MDA含量上升幅度逐渐增大;贮藏40～100 d时，T1和T2处理荸荠的MDA含量差异不显著，但二者均显著低于CK1和CK2荸荠的MDA含量;贮藏结束时，T1处理荸荠的MDA含量为2.78 μmol/gFW，而CK1和CK2荸荠的MDA含量分别为4.25和4.20 μmol/gFW。可见，乳链菌肽处理荸荠可较好地延缓其MDA含量上升，从而减缓荸荠的衰老和腐烂进程。这一结果同步体现为乳链菌肽处理的荸荠烂果率处于较低状态。

2. 5 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠POD活性的影响

POD活性可作为检测果蔬成熟和衰老的一项重要指标。POD是木质素生物合成中的最后一步关键酶，木质素积累和酚类物质合成可增强果实的抗病机制，减少褐变，但POD活性的上升参与酚类物质的氧化和聚合而导致褐变加剧，故POD活性并非越高越好（张福平和李秋红，2008）。由图5可知，在冷库条件下，荸荠的POD活性随贮藏时间的延长总体呈先下降后上升再下降的變化趋势，贮藏至第20 d时出现最低值，贮藏至第60 d时出现最高值。在贮藏期20～60 d，各处理荸荠的POD活性迅速上升，是因为随着衰老的加剧，出现H2O2积累，从而诱导POD活性上升（胡瑞斌等，2014），其中T1和T2处理荸荠的POD活性在第60 d较第20 d分别提高32.53%和38.14%，而CK1和CK2荸荠的POD活性在第60 d较第20 d分别提高105.55%和116.17%。在贮藏期60～100 d，T1和T2处理荸荠的POD活性仍显著低于对照，说明乳链菌肽可抑制荸荠POD活性快速上升。

2. 6 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠SOD活性的影响

SOD是需氧生物普遍存在的一种含硒元素金属酶，起防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统伤害的作用（Ayala-Zavala et al.，2004;曾丽萍等，2018）。由图6可知，在冷库条件下，荸荠的SOD活性随贮藏时间的延长总体上呈先上升后下降的变化趋势;CK1和CK2荸荠的SOD活性在贮藏40 d时出现峰值，较试验处理前荸荠的SOD活性分别上升137.14%和115.72%，之后荸荠的SOD活性迅速下降;T1和T2处理荸荠的SOD活性变化没有明显高峰，贮藏至第60 d时出现较大值，较试验处理前荸荠的SOD活性仅分别上升71.59%和82.67%，之后荸荠的SOD活性处于缓慢下降状态;T1、T2处理与CK1、CK2荸荠的SOD活性在贮藏40和100 d时差异显著。可见，乳链菌肽在荸荠贮藏中期抑制了SOD活性上升，同时在贮藏末期SOD活性并未快速下降进而能较好地清除超氧阴离子自由基对荸荠组织的侵害，与其有效减缓MDA含量积累的结果相一致，从而表现出较好的贮藏效果。乳链菌肽处理对荸荠的这一影响作用与对其POD活性的影响相似。

2. 7 乳链菌肽对贮藏过程中荸荠PAL活性的影响

PAL是植物体内催化苯丙氨酸反应产生次生物质代谢的限速酶，在果蔬伤口愈合、组织褐变、抵御病害等方面具有重要作用（丁薪源等，2015）。由图7可知，在冷库条件下，荸荠的PAL活性随贮藏时间的延长总体上呈上升趋势;整个贮藏期间，CK1和CK2荸荠的PAL活性始终保持较高水平，二者间差异不显著;在贮藏期的前20 d，各处理荸荠的PAL活性变化幅度均较小，差异不显著;贮藏40～100 d，T1和T2处理荸荠的PAL活性上升相对缓慢，显著低于CK1和CK2。说明乳链菌肽处理可缓解荸荠的病害及损伤对PAL活性的诱导，抑制荸荠贮藏期的PAL活性。

3 讨论

采后荸荠在贮藏期间极易出现表皮失水皱缩、腐烂发霉问题，常温下贮藏保鲜期十分短暂，低温条件可延长荸荠的贮藏寿命（赖传雅等，2013）。本研究在冷库条件下，以0.03%乳链菌肽处理洗净或带泥的荸荠，探讨贮藏期间荸荠的品质变化及腐烂病发生状况，结果显示，贮藏40～100 d，经乳链菌肽处理的洗净或带泥荸荠的菌落总数和烂果率虽然也随贮藏时间的延长而增加，但显著低于对照，说明乳链菌肽对采后荸荠表面微生物引起的腐烂病具有抑制效果，与谢冬娣等（2018）用咪鲜胺结合乳链菌肽在10 ℃条件下能抑制淮山腐烂指数上升的结果相一致，但贮藏寿命较淮山延长了60多天。究其原因，乳链菌肽能有效抑杀革兰氏阳性菌及其细胞通透性发生改变的革兰氏阴性菌（刘翀和杨洋，2005），冷温（6±1）℃条件可能抑制荸荠表面的真菌快速生长，同时改变革兰氏阴性菌的细胞通透性，从而拓宽乳链菌肽抑菌谱，使贮藏期荸荠腐烂病发生得到减缓。其中，乳链菌肽处理洗净荸荠比处理带泥荸荠的防治效果好，贮藏100 d的菌落总数仍低于5 lg（CFU/g），烂果率仍控制在10.00%以下，可能是带泥荸荠受水肥管理影响，球茎上微生物种类复杂（赖传雅等，2013），所带泥土的某些微生物对乳链菌肽不敏感。

本研究结果显示，随贮藏时间的延长，荸荠的TSS含量逐渐下降，MDA含量逐渐上升，是荸荠在贮藏期间自身生理活动引起的变化（刁俊明等，2015）;在贮藏中后期，经乳链菌肽处理的洗净荸荠TSS和MDA含量变化与对照荸荠差异明显，说明乳链菌肽能有效缓解荸荠的TSS含量下降和MDA含量上升，究其原因，植物受病原物侵染而发生主动防卫反应，体内酶系会发生广泛的病理变化（张福平和李秋红，2008）。乳链菌肽结合冷温通过抑制荸荠表面微生物的侵染，减缓了衰老、病害及损伤等胁迫对抗性酶POD、SOD和PAL活性的诱导。经乳链菌肽处理荸荠的POD和SOD活性未出现明显高峰，同时在贮藏末期其活性并未快速下降，从而能较好地清除贮藏期延长后超氧阴离子自由基对荸荠组织的侵害，保持较高TSS含量和减少MDA含量的积累，表现出较好的贮藏效果，与宋慕波等（2016）研究发现2%壳聚糖抑制荸荠POD和SOD活性上升的结果相似。荸荠的PAL活性随贮藏时间的延长总体上呈上升趋势，而对照荸荠的PAL活性始终处于较高水平，说明乳链菌肽可抑制荸荠贮藏期PAL活性。PAL是酚类物质和木质素生物合成中的关键酶，催化L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，影响果实组织褐变;随果实衰老或环境胁迫，酶与底物区域化被解除，在PAL、POD等一系列酶作用下更易发生褐变（张福平和李秋红，2008;王大红等，2018）。因此，控制PAL和POD活性的快速上升是延长荸荠贮藏期的重要措施之一。

4 结论

乳链菌肽可抑制荸荠贮藏期腐烂病发生和品质下降，从而延长荸荠贮藏期，0.03%乳链菌肽处理洗净的荸荠贮藏期可达100 d，仍保持较好品质。

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（责任编辑 罗 丽）