陈頔 唐艳斌 朴玮 王鸥 黄建 王丽娟

摘 要：目的：研究灵芝子实体浓缩胶囊对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用。方法：将50只健康的雌性昆明小鼠随机分成空白对照组、模型对照组、灵芝子实体浓缩胶囊低（83.5mg/kg·BW）、中（167mg/kg·BW）、高劑量组（500mg/kg·BW），每组10只。每日灌胃给药1次，连续灌胃给药37d，空白对照组和模型对照组按等量蒸馏水灌胃。给予受试物第37天，模型对照组及受试物各剂量组灌胃给予50%乙醇（13mL/kg·BW）造成急性肝损伤模型，禁食16h处死动物，测定各组小鼠肝组织中丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）、还原型谷胱甘肽（GSH）的含量并观察肝组织病理形态学变化。结果：各剂量组间小鼠与模型对照组相比，灵芝子实体浓缩胶囊高剂量组的MDA、TG含量明显低于模型对照组，差异具有显著性（P<0.05），中、高剂量组的GSH含量显著高于模型对照组，差异具有显著性（P<0.01）。灵芝子实体浓缩胶囊能显著改善肝细胞肿胀、坏死和炎性浸润状况，在脂肪变性方面各剂量组虽未发现显著性改善，但与模型对照组比较，存在缓解肝损伤的趋势。结论：灵芝子实体浓缩胶囊对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的辅助保护功能。

关键词：灵芝子实体浓缩胶囊;酒精性肝损伤;保护作用;还原型谷胱甘肽;丙二醛;甘油三酯

根据目前人群对保肝护肝功能性产品的需求和现状，探寻和筛选到抗急性酒精性肝损伤的保健品日益受到重视[1-6]。现代研究发现，灵芝在抗肿瘤[7]、免疫调节[8]、镇静安神、抗心肌缺血、调节血脂等方面均有较好的疗效[9]。灵芝中的最主要活性成分包括灵芝多糖和三萜，但对灵芝子实体这一复合体的功能研究目前偏少，本实验主要以急性酒精性肝损伤为模型，从而进一步阐明灵芝子实体浓缩胶囊对肝损伤小鼠的辅助保护功能。

1 材料与方法

1.1 受试样品

灵芝子实体浓缩胶囊，由醇提灵芝提取物、淀粉和硬脂酸镁为原辅料制成，标志性成分为总三萜和灵芝多糖。灵芝子实体原料总三萜的含量按照《保健食品功效成分检测方法》（2011版）中“总三萜的分光光度测定法”进行测定和计算;灵芝多糖含量的测定则参照《中华人民共和国药点》（2015版）一部中的“灵芝”项下的方法进行。经测定，灵芝子实体原料每100g中，总三萜的含量3.5g，以无水葡萄糖计灵芝多糖的含量为每100g8.0g。

1.2 实验动物

健康清洁级雌性昆明小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，体重18～22g，共计50只。许可证号为SCXK（京）2016-0011。饲养地点为中国医学科学院医学实验动物研究所动物房，级别：屏障环境，动物房使用许可证号：SYXK（京）2013-0019。各组小鼠均给予正常基础饲料，自由进食和饮水。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 主要仪器 电子天平、离心机、Gene5全自动多功能酶标仪、加样器、恒温水浴锅、混旋器、组织匀浆器、脱水机、包埋机、石蜡切片机、染色机、封片机、显微镜。

1.3.2 主要试剂 无水乙醇（新乡市三伟消毒制剂有限公司，批号20150905）、甲醛（天津市福晨化学试剂厂，批号20151207）、0.9%氯化钠溶液（石家庄四药有限公司，批号1609053201）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成科技有限公司，批号20170528）、还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（南京建成科技有限公司，批号20170526）、甘油三酯（TG）测定试剂盒（南京建成科技有限公司，批号20170526）。

1.4 方法

1.4.1 受试样品剂量的确定 《中华人民共和国药点》（2015版）一部的“灵芝”中，灵芝生药饮片的用量为6～12g，按每天平均用量10g生药饮片进行计算，本研究选用经过加工处理好的灵芝子实体浓缩胶囊内容物进行实验，经过综合考虑和胶囊工艺制备的情况，最后选用浓缩倍数相当的条件，即确定人体对该浓缩胶囊的推荐摄入量为1g/d。

1.4.2 动物实验分组 健康昆明种雌性小鼠50只，按体重随机分成5组，每组10只，灵芝子实体浓缩胶囊按成人60kg体重计，受试物推荐剂量相当于每人每日16.7mg/kg。实验设计按人体推荐量的5、10、30倍，即每日83.5、167、500mg/kg·BW为低、中、高剂量组。同时设空白对照组和模型对照组。

1.4.3 动物实验方法 实验方法按照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）中对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法中酒精肝损伤模型进行。动物适应饲养4d后，各剂量组灌胃给予受试物，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水，灌胃量10mL /kg·BW，连续37d，每天1次。动物每周称重2次，按体重调整灌胃量。给予受试物第37天，模型对照组及受试物各剂量组灌胃给予50%乙醇，灌胃量为13mL/kg·BW，造成急性酒精性肝损伤模型，空白对照组给予蒸馏水，禁食16h处死动物，剖取小鼠肝脏左叶用10%甲醛固定，在肝组织中部做横切面取材，-20℃恒冷低温条件下切片（厚6μm），光镜下做病理组织学检查;另取肝脏用生理盐水制成10%的肝匀浆，检测肝组织中MDA、TG、GSH的含量。乙醇中毒小鼠肝脏病理组织学变化与评分标准为：对每张病理切片全面进行观察（不得遗漏任何视野），观察脂肪滴在肝脏的分布、范围和面积，分别记录每个视野中的各种病变所占据视野的面积，累计所观察视野的病变总分，并根据脂肪改变程度进行量化，按“-（0分）、+（1分）、++（2分）、+++（3分）、++++（4分）”;量化积分：肝细胞内脂滴散在、稀少，0分;含脂滴的肝细胞不超过1/4，1分;含脂滴的肝细胞不超过1/2，且超过1/4，2分;含脂滴的肝细胞不超过3/4，且超过1/2，3分;肝组织几乎被脂滴替代，4分。肝脏炎性细胞浸润、细胞肿胀和坏死程度的量化和积分标准同脂肪变性相同。

1.5 数据分析

采用SPSS 717.0统计软件进行数据分析。各剂量组与模型对照组比较采用方差分析，用多个实验组和1个对照组间均数的两两比较方法进行统计，对方差不齊的数据进行适当的变量转换，待满足方差齐要求后，用转换后的数据进行统计。模型对照组与空白对照组比较采用t检验。计量数据采用均数±标准差（±s）表示。

1.6 结果判定

肝脏MDA、TG和还原型GSH三项检测指标结果阳性，或肝脏MDA、TG和还原型GSH三项指标中任两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性，即可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

2 结果与分析

2.1 灵芝子实体浓缩胶囊对小鼠体重的影响

由表1可知，小鼠各剂量组及模型对照组动物初始体重和终体重与空白对照组动物体重比较，差异均无显著性（P>0.05），表明灵芝子实体浓缩胶囊在本实验条件下对小鼠的体重无明显影响。

2.2 灵芝子实体浓缩胶囊对动物肝组织中MDA的影响

由表2可见，与空白对照组比较，模型对照组的MDA明显高于空白对照组，差异具有显著性（P<0.01），说明乙醇引起了小鼠组织氧化应激反应。灵芝子实体浓缩胶囊低、中、高剂量组小鼠肝脏的MDA含量有所降低并呈一定的剂量关系，其中，与模型组比较，灵芝子实体浓缩胶囊500mg/kg·BW剂量组的MDA明显低于模型对照组，差异具有显著性（P<0.05），其他各剂量组与模型组比较无统计学意义，但MDA含量也逐渐减少。

2.3 灵芝子实体浓缩胶囊对动物肝组织中TG的影响

由表3可见，与空白对照组比较，模型对照组的TG明显高于空白对照组，差异具有显著性（P<0.01），说明乙醇所致急性肝损伤小鼠肝脏TG能力显著降低。灵芝子实体浓缩胶囊500mg/kg·BW剂量组的TG与模型对照组比较，明显低于模型对照组，差异具有显著性（P<0.05）。

2.4 灵芝子实体浓缩胶囊对动物肝组织中还原型GSH的影响

由表4可见，与空白对照组比较，模型对照组的GSH明显低于空白对照组，差异具有显著性（P<0.05），说明急性酒精性肝损伤模型造模成功。灵芝子实体浓缩胶囊167、500mg/kg·BW剂量组的GSH明显高于模型对照组，差异具有显著性（P<0.01）。

2.5 灵芝子实体浓缩胶囊对肝组织病理检查结果的影响

如附图所示，对酒精性肝损伤小鼠的肝组织进行HE染色，进行组织形态学观察。从肝脏外观来看，空白对照组肝组织色泽鲜红，肉眼未见明显病变，模型组和各剂量给药组肝组织表面色泽发黄，且肉眼可见组织纹理粗糙，但模型组病变最为明显。病理切片结果显示，空白对照组肝小叶结构清晰，肝细胞以中央静脉周围为中心成板状排列，位于中央肝结构正常，未见明显病理变化。模型对照组小鼠视野内几乎所有肝细胞高度肿胀、界限不清，静脉周围部分区域炎性细胞浸润，肝细胞脂肪变性明显，且出现肝细胞灶性坏死，表明造模成功。灵芝子实体浓缩胶囊低、中、高剂量组肝组织形态、结构和肝细胞脂肪变性、炎性浸润等情况，与模型对照组比较有所恢复，脂肪病变程度有所减轻，但显著性并不明显，而炎性细胞浸润程度则高剂量组显著优于模型对照组（P<0.05），细胞肿胀方面，灵芝子实体浓缩胶囊各剂量组与模型对照组比较均有显著性差异（P<0.05），高剂量组病变程度积分最低，细胞坏死程度除模型组出现个例坏死外，其他各剂量组均未观察到明显细胞坏死现象。由表5～8可见，在肝组织病理检查中，与空白对照组比较，模型对照组的肝脏脂肪改变、炎性浸润、细胞肿胀和坏死的程度明显高于空白对照组，差异具有显著性（P<0.05），说明急性酒精性肝损伤模型造模成功。灵芝子实体浓缩胶囊各剂量组的肝脏脂肪改变程度与模型对照组比较，脂肪变性存在减缓的趋势，但差异无显著性（P>0.05），炎性细胞浸润程度以高剂量组与模型对照组比较差异具有显著性（P<0.05），细胞肿胀和坏死程度各剂量组与模型组比较均存在显著性差异（P<0.05）。

3 讨论

本研究中灵芝子实体浓缩胶囊为灵芝提取物，其主要成分为总三萜和灵芝多糖，灵芝多糖的保健功能多集中于降血糖、降血脂、抗肿瘤和免疫调节等[11-17]，而灵芝总三萜的功效成分则多体现于抗肿瘤、保肝、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性等作用[18]。本实验主要从小鼠肝组织中MDA、TG和GSH三项指标与肝组织病理的改变，进而观察灵芝子实体浓缩胶囊对小鼠急性酒精性肝损伤的影响，结果表明，模型组MDA、TG、GSH水平均与空白对照组有显著性差异，表明造模成功。灵芝子实体浓缩胶囊明显降低急性酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA、TG的含量，提高肝组织中GSH水平，由此提示，灵芝子实体浓缩胶囊对急性酒精性肝损伤肝脏的保护作用可能与其增强机体自由基的清除能力，抑制自由基反应，抗脂质过氧化相关，这与贺国芳[19]、张兰兰[16]、薛承斌等[20]对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究结果一致。肝脏病理组织形态学方面，结果表明，虽然统计结果脂肪变性指标未表现出模型组与各剂量组的显著性差异，但与模型组比较，各剂量组肝细胞脂肪变性程度有所缓解，脂肪病变程度减轻，积分降低，而炎性细胞浸润程度则高剂量组对模型组显著性改善，结合生化指标分析，这与肝组织TG水平变化基本一致，此研究结果与乔靖怡等[21]在金丝桃苷对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用一文中的结果大致相同。该实验结果表明，灵芝子实体胶囊对小鼠的急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能与增强机体脂质过氧化、清除和抑制机体自由基能力等因素相关，这与先前大量的调查研究结果保持一致，因此，灵芝子实体浓缩胶囊对急性酒精性肝损伤小鼠具有一定的保肝作用。◇

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