周 秀 花,2，赵 高 峰2，赵 晓 辉2，张 盼 伟2，李 昆2，熊 楠，金 士 威

(1.中南民族大学 化学与材料科学学院，湖北 武汉 430074； 2.中国水利水电科学研究院，北京 100038)

随着工农业的发展和人民生活水平的日益提高，各种化工产品、医药产品、农业化肥、除草剂以及杀虫剂等有机化学产品通过工业废水和生活污水的直接排放以及农用化学品的土壤渗漏、地表径流和大气沉降进入到水体中，使得大量的有机污染物进入水环境，给水体的生态环境造成严重的威胁[1]。内分泌干扰物(Endocrine disruptors, EDs)是一类广泛存在于生活污水、河流、湖泊及海洋等水环境中的污染物。20世纪90年代以来的研究表明，在长期、低剂量暴露下，EDs能够干扰人类和动物的内分泌系统，导致生殖功能下降、生长发育异常和免疫力降低等一系列症状，甚至有致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对生态环境和生物体的健康产生危害[2]。EDs在水环境中的污染特征研究已是当前学术界和公众共同关注的热点问题之一。

根据内分泌干扰机制，EDs可分为雌激素类干扰物、雄激素类干扰物、甲状腺激素类干扰物、肾上腺素类干扰物、胰岛素类干扰物、孕激素类干扰物、糖皮质激素类干扰物等。其中，对甲状腺激素的干扰效应的研究，是近年来学术界广泛关注的热点。

甲状腺是脊椎动物体内重要的内分泌腺，其分泌的甲状腺激素(Thyroid Hormone，TH)在调节生长、组织分化、能量代谢和维护大脑功能等方面发挥着非常重要的作用，是人类和动物生理过程中不可或缺的重要激素[3]。研究证实多种环境污染物，包括酚类化合物、溴代阻燃剂、农药等可影响甲状腺的正常功能，如抑制TH的合成和分泌、抑制甲状腺对碘的吸收等[4]。这类对TH有干扰效应的化合物被称为甲状腺激素干扰物(Thyroid Hormone Disruptors，THDs)。THDs已成为继环境雌激素之后最重要的一种EDs。研究显示，多种THDs可以通过与TH或TH受体结合模拟TH作用来影响甲状腺激素的合成、分泌、转运、代谢等环节，形成多种作用机制来干扰甲状腺功能。例如双酚A(BPA)[5]、多溴联苯醚(PBDEs)和多氯联苯(PCBs)[6]通过干扰甲状腺激素(TH)的信号传导和调节，导致甲状腺功能紊乱。有研究发现多种THDs的暴露能引起甲状腺滤泡细胞肥大、厚度增大、胶质减少、血管增生和充血等现象[7]，如Lee S.H.等[8]研究表明2,3,7,8-四氯代二苯并二噁英(TCDD)能导致大鼠甲状腺组织充血和肿胀，滤泡体积显著减小；Zhang Z.F等[9]关于2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)可引起小鼠肝脏甲状腺激素受体TRα1、TRβ1mRNA蛋白的表达，表明了THDs对甲调基因及TH代谢关键酶也产生影响。

鉴于水环境中的THDs种类繁多、分布广泛，已经对人类和动物的健康存在潜在的威胁，开发建立水环境中的快速、可靠、灵敏、准确THDs的检测方法已成为当务之急。本文综述了目前水环境中THDs的主要分析方法—化学分析法和生物测试法，以期更好地开展对水环境中THDs的污染特征及生物学效应评价。

1 甲状腺激素干扰物的化学分析方法

甲状腺激素干扰物在水环境中浓度极低，且水体中复杂基质干扰较大，在分析前一般要经过样品前处理过程，以富集痕量组分、消除基体干扰、提高方法灵敏度以及去除对仪器或分析系统有影响的物质[10]。化学分析方法主要分为样品前处理技术和仪器分析方法。而前处理技术是仪器分析前的必要步骤。因此，样品前处理在化学分析中起着重要作用，它是水环境中THDs分析的关键环节之一。

1.1 样品前处理技术

在环境水样分析中，采集的样品具有复杂性、多样性以及痕量性等特点，因此样品在进行仪器分析检测之前，一般需要对样品进行前处理，以去除具有干扰作用的非目标化合物[11]。样品前处理包括提取、净化、浓缩等步骤。对于水环境中THDs检测，常见的前处理技术包括：采用索氏萃取(Soxhlet extraction, SE)对水环境中固体或半固体的样品进行目标化合物的提取，通过液液萃取(Liquid-liquid extraction, LLE)对水环境中的水体进行目标化合物的提取。作为最传统的萃取方法，它们具有萃取效果好、设备装置简单、成本低、可同时萃取多个样品等优点，但也存在萃取剂用量大、耗时长、分析人员劳动强度大等缺点。此外，超声波萃取(UE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、微波辅助萃取(MAE)、分散液液萃取(DLLME)、超临界流体萃取(SFE)、单液滴微萃取(SDME)、搅拌棒吸附萃取(SBSE)、分子印迹固相萃取(MISPE)等都是近年来普遍使用的萃取技术。表1对这些萃取方法进行了比较。

1.2 仪器分析方法

1.2.1气相色谱(GC)和气相色谱-质谱法(GC/MS)

GC是THDs最常用的测定方法(见表2)。为了提高分析技术的全面适应性，常常将具有高选择性、高灵敏度以及高分辨率的质谱与许多分离过程相联接。对于THDs的定性定量研究，应用最广、发展最快的方法是GC/MS，GC/MS由于具有良好的分离效率以及高分辨率被用于测定环境水体中的THDs。目前，已建立一个包含十几万种标准物质的质谱库，例如美国国家标准技术研究院建立的NIST谱库[21]，能够快捷查出物质及其性质。近年来，GC/MS法因其高灵敏度、高通用性和高选择性而成为检测痕量THDs的重要手段，且经选择离子检测(SIM)可以达到更高的灵敏度，同时能够准确证明化合物的结构。但是GC/MS并不适用于一些热不稳定性、需要衍生化再进行检测的THDs。

表1 样品前处理萃取技术的比较Tab.1 Comparison of extraction techniques in sample pretreatment

1.2.2液相色谱(LC)和液相色谱-质谱法(LC/MS)

虽然GC和GC/MS是水环境中THDs检测的一种重要的方法，但是随着THDs种类的增加，对仪器条件要求越来越高。而LC能有效分离热不稳性高沸点化合物的分离与MS很强的组分鉴定相结合形成了LC/MS技术。LC/MS是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段，可以对THDs进行可靠和明确的量化[22]。对于那些相对分子量大、高沸点、热稳定性差的THDs(如酚类化合物、固醇类等化合物)，LC和LC/MS方法显示出其优势，有助于全面把握各种THDs的污染现状。M Khaksari等[23]应用LC/MS检测废水中THDs，检出限可达到ppt级水平。

伴随着超高效液相(UPLC)及其超高效液相质谱(UPLC/MS)甚至是超高效液相色谱—三重四级杆串联质(UPLC-MS/MS)的出现，THDs的分析和检测效率大大提高，试剂消耗大幅下降。UPLC-MS/MS是一种准确度高、精密度高、样品处理简单、无杂质干扰、分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合THDs的分离。

2 甲状腺激素干扰物的生物测试方法

化学分析定性准确，但设备要求高，费用昂贵，而且不能直接检测出水环境甲状腺激素的生物干扰效应，而生物测试方法可通过研究水环境中水体作用下生物体内基因表达的上调或下抑、蛋白合成的改变、细胞的增殖以及组织的病变等各种指标的变化，直接表征甲状腺激素可能给生物体带来的影响。因此，在环境THDs研究领域内，生物检测法成为近年来的研究热点。生物测试法一般按照测试对象不同可以分为活体检测和离体检测。

表2 水环境中甲状腺激素干扰物化学分析方法Tab.2 Chemical analysis of THDs in water environment

2.1 活体检测法

活体检测法[40]主要通过检测水体中暴露于生物体内甲状腺激素水平、观察甲状腺组织改变等表征甲状腺激素的生物干扰效应。活体检测对象包括鱼类、哺乳类、两栖类动物和蛙类等。其中，鱼类为常用的研究对象，主要包括斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟鱼(Rainbow trout)、黑头木鱼(Pimephales promelas)等(见表3)。孙丁等[41]在叶枯宁对大鼠血清FT4和TSH水平的影响及其时效关系研究中发现，该农药对大鼠血清FT4和TSH水平的影响发生在5 d之内，并可继发引起甲状腺増生。通过观察活体THDs形态学、组织病理学、生殖和特定生化指标的变化可以有效地对THDs进行检测和评价。

2.2 离体检测法

活体检测能快速、灵敏地确定外源化合物的内分泌干扰作用[52]，相比于活体检测法，离体检测是一种快速而又经济有效的方法，由于该方法的特异性，它能达到更低的检测限[53]，能够直接测定环境样品的内分泌干扰活性。离体检测法主要有分子检测法、组织检测法、细胞检测法等。其中，分子检测法和组织检测法常用于甲状腺疾病等医学研究，而细胞检测法在水环境甲状腺激素干扰效应中应用最广、发展最快。

表3 水环境中甲状腺激素干扰物的活体检测Tab.3 In vivo detection of THDs in water environment

2.2.1分子检测法

甲状腺疾病是内分泌系统最常见的疾病之一，也是人群中常见的疾病[54]。甲状腺疾病的诊断十分重要，对临床医师的诊断方案起到关键性作用[55]。在医学方面，细胞检测存在不明确的非典型病变诊断。随着分子遗传学的发展，分子基因检测能够明显提高细胞检测结果[56]。Cantara S等研究表明细针穿刺细胞学与分子检测结合能够提高甲状腺疾病的诊断效果[57]。

2.2.2组织检测法

生物组织具有复杂的调控机制，且局部TH作用具有组织特异性优化[58]。组织检测是以组织特异性方式评估TH浓度，其具有可操作性强、简便、损伤小等优点[59]。Liu QJ等[60]研究表明多态性上皮黏蛋白(PEM)在甲状腺癌组织中的表达及其分布特点可作为甲状腺癌的鉴别诊断指标。

2.2.3细胞检测法

水环境中细胞检测法所用的细胞须富含TR，同时具有甲状腺激素依赖性增殖的特点[61]。细胞检测法主要采用的细胞系包括大鼠垂体瘤细胞GH3、甲状腺细胞系中的FRTL-5、PCC13、Th1以及受体报告基因等，细胞经过改造后再对THDs进行检测的方法称为受体报告基因检测。常见的甲状腺激素干扰物的细胞检测应用如表4所示。

表4 水环境中甲状腺激素干扰物的细胞检测应用Tab.4 In vitro detection of THDs in water environment

2.2.4重组基因双杂交酵母检测法

重组基因双杂交酵母检测法的主要原理为：水环境中的THDs进入酵母细胞，然后通过与甲状腺激素受体和受体共激活因子蛋白结合，启动报告基因LacZ的表达，表达产物β-半乳糖苷酶的活性可用于表征化合物对TR的干扰活性。李剑等已成功构建了重组人甲状腺激素受体(hTR)和与hTR对应的共激活因子基因的双杂交酵母体系，还对一系列环境内分泌干扰物进行了筛选[62]。但是，当外源化合物进入人体后，体内的代谢酶会对外源化合物进行芳烃化、磺化、甲基化、羟基化等作用，这些作用能促使一些化合物的内分泌干扰效应造成生物灭活或是生物活化[63]。重组基因双杂交酵母检测法是通过构建重组TR基因酵母，用来检测水环境水样中甲状腺激素干扰活性[64]。通过对北京地区不同水体THDs的活性检测发现，高碑店污水处理厂的AH当量为16.12～424.51 μg/L[65]、官厅水库的AH当量为21.00～2147.20 μg/L[66]以及北京市饮用水源地的NH3当量为180.80～280.20 μg/L[67]，表明这些水体均有检测出TR抑制活性，但尚未检测出TR诱导活性。重组基因双杂交酵母检测法具有操作简单、价格低廉的特点，因此在水环境的THDs检测中得到了广泛的应用。

3 展 望

鉴于水环境中的THDs对人类和动物存在健康风险，开展水环境中THDs的筛查与毒理学效应评价具有重要的现实意义。虽然目前国内外已经对水环境中THDs的分析开展了大量的研究，但是尚不深入，而且进入水环境中的THDs越来越多，今后应该从以下几个方面开展更深入的研究工作：① 目前，对水环境中的THDs的分析主要以复杂、昂贵的仪器分析方法为主，前处理过程复杂，对多种THDs的富集效果差，有必要开发富集能力强、选择性好的前处理方法，以实现灵敏，经济、高通量的分析；② 应开发快速、灵敏、高效的生物检测法，尤其是利用转基因等技术实现高效、高通量的离体检测；③ 水环境中的THDs浓度低，需要开发长期低剂量暴露的活体生物评价方法，以全面、正确评估THDs的健康风险。