何 伟，李菁菁，包可翔，颜奕华，姜振锟，林 俭，陈善义，李易非

福建中烟工业有限责任公司技术中心，厦门 361021

淀粉是烟草中一类重要的碳水化合物，新鲜烟叶通过调制，大部分淀粉经酶解反应降解为还原糖。但调制后的烟叶仍残留少量淀粉，这对烟叶内在质量有不利的影响[1]。以淀粉形式存在的糖类在卷烟燃吸时会影响燃烧速率和完全性，并产生糊焦气味，影响烟叶的香味和内在品质，因此淀粉含量的高低对烤烟烟叶的品质有重要影响[2,3]。现有调制方法中淀粉降解转化不够充分，导致中国成品烟叶的淀粉含量普遍偏高，约为4%～6%，远高于国外优质成品烟中的淀粉含量(约为 1%～2%)[4,5]。烤后烟叶淀粉残留量过高已成为制约中国烟叶质量提高的重要因素之一。

近年来，利用外加微生物或酶制剂降低烟叶中的淀粉含量、提高烟叶的可用性己成为烟叶原料研究的热点之一。冯颖杰等[6]研究发现，向烟叶中施加高效产淀粉酶的苏云金芽孢杆菌，烟叶中淀粉大幅度降低，烟叶的总糖、还原糖含量上升，有效提升了烟叶的整体质量。沙云菲等[7]研究了淀粉酶复合酶制剂对上部烟叶的降解效果，处理后效果显著。李晓等[8]采用α-淀粉酶、糖化酶分别处理烤烟和白肋烟，处理后烟叶品质明显改善。此外，这些生物技术在烟草中的应用还必须考虑到微生物和酶制剂自身所带来的污染、安全性和失活不稳定等多种因素。

本实验室前期从云南马龙C3F-2014烟叶表面筛选出一株能够高效表达淀粉酶的Bacilluskoreensis。本研究以该菌株为研究对象，利用响应面法优化了其发酵培养基的碳源、氮源和金属离子，提高了Bacilluskoreensis表达淀粉酶的产量，为烟草天然源淀粉酶处理烟叶，提高烟叶品质的工业化应用提供了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

1.1.1Bacilluskoreensis，由云南马龙C3F-2014片烟分离纯化得到。

1.1.2 种子培养基(LB培养基)：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化钠，pH=7.0。

1.1.3 初始发酵培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)：3 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化钠，pH=7.0。

1.2 试剂与仪器

试剂：胰蛋白胨等生物试剂，葡萄糖、淀粉、氯化钠等分析纯试剂，DNS等化学纯试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司；牛肉浸膏购自广东环凯微生物科技有限公司；酵母粉购自英国Oxoid公司。

主要仪器设备：SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；CLC-B2V-M/CLC 222-TV型恒温培养箱，MMM Group(德国)；1-14型离心机，SIGMA(德国)；DMG-9423A型烘箱，上海精宏；QS-2A型切丝机，郑州嘉徳机电科技有限公司；Lambda 35型分光光度计，PerkinElmer(美国)；VX-95型灭菌锅，Systec(德国)；Milli-Q Integral 5型纯水机，Millipore(美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种培养

1.3.1.1 平板活化

从甘油管中将菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37 ℃恒温培养12 h。

1.3.1.2 种子培养基培养

从平板上挑取单菌落接种种子培养基，发酵培养6 h至培养基浑浊，温度为37 ℃，摇床转速为180 rpm。

1.3.1.3 发酵培养基培养

按3%的接种量将种子液接种于发酵培养基，发酵培养36 h，测定淀粉酶活。

1.3.2 淀粉酶活的测定

1.3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

按表1配制不同浓度的葡萄糖溶液反应体系，沸水浴反应5 min，冷却后加蒸馏水定容到25 ml。0号为空白，作为调零管。用可见光分光光度计在540 nm波长处测定吸光光度值。

表1 葡萄糖标准曲线配置表

1.3.2.2 粗酶液淀粉酶活的测定

将1 mL发酵液和1 mL 1%淀粉溶液混合并在 37 ℃水浴条件下保温5 min(混合之前各自在37 ℃预热5 min)。加入1.5 mL DNS试剂后在沸水浴5 min使酶失活，冷却后用蒸馏水定容到25 mL。空白为发酵液和淀粉溶液混合直接沸水浴，再加1.5 mL DNS，沸水浴5 min，冷却后用蒸馏水定容到25 mL。用可见光分光光度计在540 nm波长处测定样品吸光光度值。

1.3.2.3 淀粉酶活性定义及计算方法

淀粉酶活力单位定义(U/mL)：在37 ℃条件下，1 mL酶液每分钟水解淀粉产生1 μg葡萄糖所用的酶量为1个酶活力单位。

淀粉酶酶活力根据以下公式进行计算：

淀粉酶酶活力(U/mL)=生成的葡萄糖毫克数×N×1 000/5

式中：N-稀释倍数；1 000-转化成 μg；5-反应时间 5 min。

1.3.3 单因素试验

分别对碳源、氮源、金属离子、氯化钠浓度、接种量、培养温度、初始pH进行优化，测定每种因素对淀粉酶活的影响，选择最佳培养基成分。

1.3.4 PB设计

PB设计用于考察8个独立变量对响应值也就是淀粉酶活的影响，从而挑选出影响显著的因素。每个独立变量有个两个水平，分别表示为+1和-1，各因素的设计浓度见表2。

表2 PB设计培养基组分和水平

1.3.5 BBD响应面设计

Box-Behnken设计适用于2～5个因素的优化试验。基于PB试验设计和最陡爬坡试验的试验结果，采用3因素的Box-Behnken design(BBD)设计来分析各因素之间的关系并得到最优培养基配方。以PB设计筛选得到的对淀粉酶活影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，每个因素设有-1.68、-1、0、+1、+1.68五个水平(见表3)。

表3 BBD设计的因素水平

2 结果与分析

以牛肉膏蛋白胨培养基作为初始发酵培养基对Bacilluskoreensis的发酵培养基进行优化，初始发酵培养基发酵所得到的淀粉酶活为565.13 U/mL。

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

碳源是构成菌体的基本骨架，是菌体生长的能量来源，通过影响菌体的呼吸、能量供给、生长及相关代谢最终影响抗生素等次级代谢产物的产量[9]。选择15 g/L的不同碳源进行碳源优化试验，结果如图1所示，以淀粉作为碳源时酶活最高，其次是蔗糖和葡萄糖。因此，在下个阶段的PB设计中，将淀粉作为考察因素。

2.1.2 氮源对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

氮源在合成菌体各种初级、次级代谢产物等含氮物质的过程中发挥着重要作用，同时在发酵生产中氮源起着调节菌体的生长及生物量的作用[10]。选择20 g/L的不同氮源进行氮源优化试验，结果如图2所示，菌株以蛋白胨作为氮源时酶活较高，其次是酵母粉培养基。因此，在下个阶段的PB设计中，将蛋白胨和酵母粉含量作为考察因素。

图1 不同碳源对淀粉酶活的影响Fig.1 The effect of different carbon sources on amylase activity注：1.淀粉，2.葡萄糖，3.乳糖，4.蔗糖，5.麦芽糖，6.对照(CK)。Note：1.Starch,2.Glucose,3.Lactose,4.Sucrose,5.Maltose,6.Contrast(CK).

图2 不同氮源对淀粉酶活的影响Fig.2 The effect of different nitrogen sources on amylase activity注：1.蛋白胨，2.酵母粉，3.胰蛋白胨，4.牛肉膏，5.牛肉膏+蛋白胨，6.牛肉膏+胰蛋白胨。Note:1.Peptone,2.Yeast extract,3.Tryptone,4.Beef extract,5.Beef extract+Peptone,6.Beef extract+Tryptone.

2.1.3 金属离子对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

金属离子是微生物生命活动中必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶的活性中心的组成部分、维持细胞结构的稳定性等。不同金属离子产酶发酵结果见图3，培养基中添加Ca2+、Fe2+对菌株产酶有促进作用，而添加Mg2+和Zn2+对菌株产酶有一定的抑制作用，尤其是Zn2+对Bacilluskoreensis产酶有显著的抑制作用。Ca2+和Fe2+的浓度试验表明，添加浓度为0.5 g/L的Ca2+和Fe2+时，菌株酶活最高。因此，在下个阶段的PB设计中，将CaCl2和 FeSO4·7H2O作为考察因素。

2.1.4 不同盐浓度对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

不同盐浓度产酶发酵结果见图4，随着培养基盐浓度的增加，菌株产酶活力逐渐下降。当不添加盐时，酶活最高，盐浓度高于0.8%时，淀粉酶活显著下降。因此，Bacilluskoreensis培养基选择不添加 NaCl。

图3 不同金属离子对淀粉酶活的影响Fig.3 The effect of different metal ion on amylase activity

图4 不同NaCl浓度对淀粉酶活的影响Fig.4 The effect of different concentrations of NaCl on amylase activity

2.1.5 不同接种量对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

由图5可知，接种量对Bacilluskoreensis产酶影响较大。3%的接种量较之2%的接种量，酶活明显提升，而5%和3%的接种量酶活基本持平，因此，选取3%的接种量为最佳接种量。

图5 不同接种量对淀粉酶活的影响Fig.5 The effect of different inoculum size on amylase activity

2.1.6 不同初始pH对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

pH 值是衡量培养基酸碱度的一个重要指标，发酵过程中主要影响微生物对营养物质的吸收利用以及代谢产物的分泌，从而影响酶活力，每一种微生物都有其生长发酵的适宜 pH 范围。由图6可知，pH 值从5.0到8.0酶活随 pH 的增加而增加。pH 为 8.0 时，酶活达到最大值，继续增加 pH 值，酶活迅速降低。从总的变化趋势来看，中性偏碱性环境有利于菌株产酶。因此，确定8.0为菌株产酶最佳初始 pH 值。

图6 不同初始pH对淀粉酶活的影响Fig.6 The effect of different initial pH on amylase activity

2.1.7 不同培养温度对Bacilluskoreensis表达淀粉酶的影响

不同温度产酶发酵结果表明，温度对产酶影响很大，温度过低，微生物代谢缓慢，随着温度升高，代谢加快，由图7可以看出37 ℃时酶活最高，之后随着温度的升高，酶活反而降低。因此，确定 37 ℃为产酶最适培养温度。

图7 不同温度对淀粉酶活的影响Fig.7 The effect of different temperature on amylase activity

2.2 Plackett-Burman设计

通过单因素试验表明，在Bacilluskoreensis产酶过程中，对其影响较大的8个变量为淀粉含量、蛋白胨含量、酵母粉含量、CaCl2含量、FeSO4·7H2O含量、NaCl含量、接种量和初始pH，再加上3个虚拟变量，每个变量有高(+)、低(-)2个水平[11]，采用Design-Expert软件设计试验，共12组试验(表4)。使用Design-Expert软件对表4进行分析，得到 PB设计方差分析结果。由表5可知，该模型的P值 =0.009 4，表明该模型显著(P<0.05)。上述8个因素对淀粉酶活的影响排序为其中淀粉含量>蛋白胨含量>CaCl2含量>NaCl含量>接种量>初始pH>酵母粉含量>FeSO4·7H2O含量，且淀粉含量、蛋白胨含量和CaCl2含量为显著因素。

表4 PB设计实验结果

注：X1：淀粉含量；X2：蛋白胨含量；X3：虚拟因素1；X4：虚拟因素2；X5：酵母粉含量；X6：虚拟因素3；X7：CaCl2含量；X8：FeSO4·7H2O含量；X9：NaCl含量；X10：接种量；X11：初始pH。

Note:X1:starch;X2:peptone;X3:the virtual factors 1;X4:the virtual factors 2;X5:yeast extract;X6:the virtual factors 3;X7:CaCl2;X8:FeSO4·7H2O;X9:NaCl content;X10:inoculum size;X11:initial pH.

表5 PB设计各因数效应分析

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同。

Note:*means significant difference atP<0.05,**means extremely significant difference atP<0.01,the same as below.

由上述 Plackett-Burman 试验得到的回归方程为：

淀粉酶活=261.03+15.58A+12.41B-0.13E+128.74G+1.33H+1.81J+3.95K-3.59L

其中A为淀粉含量，B为蛋白胨含量，E为酵母粉含量，G为CaCl2含量，H为FeSO4·7H2O含量，J为NaCl含量，K为接种量，L为初始pH。方程拟合的相关性为R2=98.71%，表明此多项式方程很好地模拟和解释了 Plackett-Burman 的试验结果。

2.3 最陡爬坡试验

最陡爬坡法可以确定主要影响因素的水平，以其试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域[12]。最陡爬坡试验结果见表6。由表6可知，淀粉含量为16 g/L，蛋白胨含量为22 g/L，CaCl2含量为0.6 g/L时，实验组合4的响应值(淀粉酶活)达到最高，此后淀粉酶活开始降低，这说明适当增加培养基中碳源、氮源以及金属离子的含量有助于菌体的产酶，但过多的添加反而造成不利影响，因此选择适宜的添加量尤为重要。选取实验号4试验组合中各种因素水平作为后续Box-Behnken试验设计的中间点。

表6 最陡爬坡试验设计及结果

2.4 Box-Behnken中心组合设计

响应面法可通过较少的试验，较短的周期在整个区域内给出因素与响应值之间的明确函数关系，且精度更高，同时能够研究几种因素间的交互作用。根据最陡爬坡试验筛选出的试验中心点，采用Box-Behnken试验设计，利用Design Expert 10软件进行3因素3水平的响应面分析试验，试验设计及结果见表7。建立以淀粉酶活为目标函数的二次回归方程，并对所得到的回归方程进行方差分析与显著性检验，结果见表6。使用Design-Expert软件进行分析，得到一个3元2次方程：

Y=-1 509.26+96.41A+83.43B+2 577.94C-0.38AB-28.58AC-3.68BC-1.96A2-1.73B2-1 885.86C2

方程中，A为淀粉含量，B为蛋白胨含量，C为CaCl2含量。方程中正号表示协同效应，而负号表示拮抗效应[13,14]。该方程的R2=0.916 3，表明模型能解释91.63%淀粉酶产量的变化，回归拟合程度较好。模型的ANOVA结果见表8。其中模型的P>F值=0.000 3，说明该模型是一个显著并十分有效的模型。从ANOVA还可以看出淀粉和CaCl2在模型中是影响最为显著的因素。

表7 BBD响应面设计及结果

表8 响应面二次方程模型的ANOVA值

图8分别表示了淀粉含量和蛋白胨含量、淀粉含量和CaCl2含量、蛋白胨含量和CaCl2含量的等高线图和3D图，各培养基成分的含量对应的响应值都是随着培养基成分的含量的提高先升高后降低。根据上述分析和软件的预测，Bacilluskoreensis的最优培养基组合为淀粉含量18.74 g/L，蛋白胨含量21.56 g/L，CaCl2含量0.52 g/L，预测的最高酶活为964.31 U/mL。为验证模型预测的可靠性，用预测的最优培养基条件下进行3次平行试验，得出酶活的实际平均值为959.39±22.34，与响应面拟合所得的方程预测值符合良好，说明该模型可以很好的模拟Bacilluskoreensis的产酶效率。

3 结论

生物酶法降解淀粉因为条件温和、易于操作、改善效果明显，在实际应用中具有一定优势，可将淀粉分解成低聚糖、半乳糖醛酸、还原糖等，减少烟草原料的刺激性和杂气，改善吸食品质，提高其在烟草行业中的使用价值[15]。生物酶法所使用的酶主要有商品酶和菌株发酵提取的酶，产淀粉菌株主要有解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、米根霉等[16]，这些高效的菌株大多不是从烟叶表面分离得到。本研究从全国多个产地片烟筛选得到的Bacilluskoreensis来源于烟叶表面，与烟草的烟香能较好的契合，对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉都有较强的降解能力，能有效协调烟草的化学成分、减少刺激、增加烟香，有很广泛的应用前景。

本研究通过单因素试验、PB设计、最陡爬坡试验和BBD响应面设计对Bacilluskoreensis的培养基进行了系统的优化。BBD响应面设计较之传统的线性回归和正交试验有周期短、试验次数少、精度高等优势，因此在微生物发酵中得到广泛的应用[17]。该方法先通过PB设计选出影响酶活的最显著因素为淀粉、蛋白胨和CaCl2，再通过最陡爬坡设计试验逼近响应面的中心点，最后通过BBD响应面设计得出最优的培养基配方。验证试验得出酶活的实际平均值为959.39±22.34 U/mL，较之初始酶活提高了69.67%，大幅度提高了淀粉酶活和片烟处理效率，为进一步微生物酶制剂的工业化应用提供了材料基础。故下一步研究将在本研究的基础上，研究Bacilluskoreensis的发酵罐条件(溶氧、转速、pH调节等)和该淀粉酶的酶学性质、分子量等，并通过硅藻土过滤、膜过滤等方法进一步精制酶液。本研究开发的酶制剂天然高效、感官评吸配伍性强，为卷烟生产企业提高上部叶的可用性和提高烟草品质提供一条新的方向并奠定了良好的基础。