韩玉竹，胡鸿晴，玉永雄，张朝鹏，范紫薇

（1. 西南大学动物科学学院 / 重庆市肉牛工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460；2. 西南大学动物科技学院 /重庆市高校草食动物工程中心，重庆 北碚 400715）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种优良的多年生豆科牧草，在世界各地广泛栽培，具有营养价值高和家畜喜食等特点，在畜牧业生产中发挥着极其重要的作用[1]。然而，病虫害已成为限制苜蓿产业可持续健康发展的重要因素[2]。目前，苜蓿上已报道约90余种病害，其中苜蓿花叶病是主要病害之一[3]。引起苜蓿花叶病的病原主要是苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)，另外还有豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus, CPMV)、白三叶花叶病毒(white clover mosaic virus, WCMV)、菜豆花叶病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV)、三叶草黄叶脉病毒(clover yellow vein virus, CYVV)、红三叶草明脉花叶病毒(red clover vein mosaic virus, RCVMV)和花生矮化病毒(peanut stunt virus, PSV)等，对苜蓿生产造成严重经济损失[4-5]。据文献报道，苜蓿病毒病在苜蓿种植区普遍发生，宁夏的苜蓿花叶病的发病率为15%～95%[6]，甘肃省兰州市和白银市苜蓿花叶病的发病率为16.08%～43.33%，且随着年限增长呈上升趋势[4]。苜蓿花叶病可导致苜蓿植株矮化、叶片皱缩变黄甚至脱落，牧草蛋白质含量下降，根瘤数减少31%～67%，牧草干重降低37%～66%，花粉萌发率降低21.5%，种子减产，易受干旱或霜冻的危害，易被其他病害侵染[3,7-8]。

国内外学者对苜蓿花叶病进行了大量的研究，主要包括病原检测[4-5]，病原的结构基因[9-10]、寄主范围、分布和危害[8]、发病规律[11]和综合防治[12]等方面。但关于病害对苜蓿生长、产量和营养品质的研究较少，且不深入，对光合作用的影响还未见报道。光合同化是影响产量和质量的主要因素，因此有必要明确不同严重度花叶病对苜蓿叶片光合作用的影响程度。本研究以紫花苜蓿为材料，分析不同严重度花叶病对叶片光合作用、植株生长及草品质的影响，并分析不同指标之间的相关关系，以期为阐明花叶病侵染导致苜蓿产量和草品质降低的机理提供思路，也为牧草病害损失估计、指导苜蓿花叶病害田间防治及牧草合理利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样地概况

采样地点位于重庆市荣昌区西南大学动物科学学院苜蓿基地 (29°41' N，105°44' E，海拔 281.5 m)。属亚热带季风性湿润气候，年均降水量为1 099 mm；年平均气温18.5 ℃，年最高气温39.9 ℃，年最低气温2.5 ℃，无霜期327 d以上。土壤类型为砂壤土，土壤pH为6.25。

1.2 试验材料

研究材料为日本引进的抗倒伏紫花苜蓿品种“Neo-tachiwakaba”，试验地种植年限为3年，苜蓿花叶病当年发病率达85%。试验前期利用DASELISA和病毒特异性引物对病株病原进行检测，证明该样地苜蓿花叶病害的病原为苜蓿花叶病毒(AMV)。

1.3 试验方法

1.3.1 苜蓿花叶病严重度分级

根据苜蓿花叶病害的田间症状，以整株为单位，将严重度分为5级，即，0级：全株无病；1级：轻微花叶，或上部1/3叶片花叶但不变形；2级：1/3～1/2叶片出现花叶症状，或者少数叶片出现变形，病株矮化约1/4；3 级：整株1/3～2/3叶片出现花叶症状，叶或叶柄变形，或者植株矮化1/3左右；4级：整株叶片花叶，叶片变形严重或坏死，病株矮化为正常植株的1/4～3/4。

1.3.2 取样时间及方法

2017年9月中旬至下旬，于紫花苜蓿第3茬初花期进行取样。随机选取5块样地，每样地根据苜蓿花叶病的不同严重度随机选取20株，测定光合和生长指标后，带回实验室进行生物量和营养指标的测定。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 光合指标

选择晴朗光照充足的天气，于08:30-11:00选择健康成熟的功能叶片(植株自上向下第3-4片三出复叶的中间叶，利用Li-6400便携式光合仪(红蓝光源)进行净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)的测定[13-16]。叶绿素含量测定采用丙酮-乙醇混合提取法。

1.4.2 生长指标

以株为单位，测定紫花苜蓿花叶病不同发生程度的生长指标。生物量为植株地上部分干重；株高为植株和地面垂直时的高度；分枝数为地面以上单株侧枝的数量；叶长和叶宽分别测量植株自上向下第3片复叶顶端小叶的长度和宽度[17]。

1.4.3 品质指标

参照兰云贤等的方法[18]，对不同病害严重度植株的常规营养成分(粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、钙、磷)进行测定。

1.5 数据分析

分别采用Excel 2010和SPSS 18.0软件进行数据处理和统计分析，差异显著性选用LSD法，相关性分析选用Pearson相关显著性检验。

2 结果与分析

2.1 对光合特性的影响

叶绿素的含量随着花叶病的严重度增加而降低，严重度为3级及以上与健株的叶绿素含量存在极显著差异(P ＜ 0.01) (表1)。严重度为4级时，病叶叶绿素含量仅为健株的64.84%。

苜蓿花叶病显著影响紫花苜蓿的光合速率，随苜蓿花叶病害严重度增加，净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)显著降低，胞间CO2浓度(Ci)增高。严重度1级及以上时，这4个光合指标与健株存在极显著差异 (P ＜ 0.01)。Pn从 14.63 μmol·(m2·s)-1降 到 4.24 μmol·(m2·s)-1， 降 低 了 71.02%， Tr从4.23 mmol·(m2·s)-1降 为 2.15 mmol·(m2·s)-1， 降低 了49.17%， Gs从 0.23 mmol·(m2·s)-1降 为 0.11 mmol·(m2·s)-1，降低了53.33%。当病害严重度为4级时，其Pn仅为健株的6.70%，Tr和Gs分别下降了65.4%和40%，Ci比健株增加了42.66%。苜蓿花叶病害严重度与光合参数的相关性分析显示，叶绿素含量、Ci浓度与严重度极显著相关；Pn、Tr与严重度显著负相关；Gs与严重度无显著相关性(表2)。

2.2 对苜蓿生长状况的影响

紫花苜蓿感染苜蓿花叶病毒后，分枝数没有显著变化，但植株矮化，叶片皱缩褪绿斑驳，紫花苜蓿生物量、株高、叶宽、叶长随严重度增加呈下降趋势(P ＜ 0.01) (表3)。严重度1级及以上的病株单株生物量和株高显著低于健株(P ＜ 0.05)，病级2级及以上的病株叶宽显著低于健株(P ＜ 0.05)。严重度为4级时病株单株生物量较健株下降29.50%(P ＜ 0.01)，矮化 28.74% (P ＜ 0.01)，叶宽减少 39.84%(P ＜ 0.01)，叶长减少 26.27% (P ＜ 0.01)。

表 1 花叶病害不同严重度植株的光合生理指标Table 1 Effect of alfalfa mosaic disease severity on the photosynthetic indexes of alfalfa

表 2 不同严重度花叶病害与苜蓿光合指标的相关性分析Table 2 Correlation between alfalfa photosynthesis and alfalfa mosaic disease severity

表 3 不同严重度花叶病害的紫花苜蓿生长状况Table 3 Effect of alfalfa mosaic disease severity on alfalfa growth status

苜蓿生长指标与花叶病严重程度的相关性分析表明，株高、叶宽与严重程度呈极显著负相关(P ＜0.01)；生物量、叶长和严重度显著负相关(P ＜ 0.05)，分枝数与病害无显著相关性(P ＞ 0.05) (表4)。

2.3 对苜蓿饲草品质的影响

紫花苜蓿感染苜蓿花叶病后，随着病害严重度的增加，粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)含量降低，酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)含量增加，粗灰分(Ash)、钙(Ca)和磷(P) 含量上升(表5)。严重度Ⅰ级及以上病株EE与健株差异极显著(P ＜ 0.01)，ADF含量差异显著(P ＜ 0.05)；严重度2级及以上病株CP与健株差异极显著(P ＜ 0.05)，NDF含量差异显著(P ＜ 0.05)；严重度3级及以上病株Ca与健株差异显著(P ＜ 0.05)；严重度4级病株P与健株差异显著(P ＜ 0.05)。与健株相比，当病害严重度为4级时，病株CP含量下降42.70%，EE含量降低70.82%，ADF和NDF含量分别增加49.29% 和23.99%。说明苜蓿花叶病严重影响了苜蓿的饲用品质。

从苜蓿花叶病严重度与饲草营养成分的相关性分析结果来看，CP、EE含量与严重度极显著负相关，ADF、NDF、Ash、Ca、P含量与严重度显著正相关 (表 6)。

表 4 不同病害严重度与苜蓿生长指标的相关性Table 4 Correlation between alfalfa growth and alfalfa mosaic disease severity

表 5 不同严重度花叶病害的苜蓿营养成分含量Table 5 Effect of alfalfa mosaic disease severity on alfalfa nutritional components

2.4 对苜蓿生长、品质和光合作用的综合影响

分枝数与各光合指标之间无显著相关性(P ＞ 0.05)；地上生物量与Pn显著正相关(P ＜ 0.05)，与Tr极显著正相关 (P ＜ 0.01)，与 Ci极显著负相关 (P ＜ 0.01)；株高、叶宽与叶绿素含量、Pn、Tr极显著(P ＜ 0.01)或显著 (P ＜ 0.05)正相关，与 Ci极显著负相关 (P ＜ 0.01)；叶长、CP与叶绿素含量极显著(P ＜ 0.01)或显著(P ＜0.05)正相关，与 Ci极显著 (P ＜ 0.01)或显著 (P ＜ 0.05)负相关；EE与与Ci极显著负相关(P ＜ 0.01)，与Pn、Tr、叶绿素含量极显著正相关(P ＜ 0.01)；Ash、ADF、NDF与叶绿素含量极显著(P ＜ 0.01)或显著(P ＜ 0.05)负相关，与 Ci极显著 (P ＜ 0.01)或显著 (P ＜ 0.05)正相关 (表 7)。

3 讨论与结论

病毒是许多重要农作物的病原，所造成的损失仅次于菌物病害[19]。苜蓿花叶病是一种苜蓿种植区普遍发生的病毒性病害，是限制苜蓿生产的重要生物因素之一。该病害的病原有10多种，症状略有不同，本研究中引起苜蓿花叶病的病原为苜蓿花叶病毒(AMV)，可侵染51科双子叶植物，为苜蓿病毒病的主要病原，认识此类病害对牧草生长、生产和饲用价值具有重要的意义。

南志标[20]研究证明，在田间随机选取一定数量无病和染病程度不同的植株相比较的方法，是进行病害损失估计切实可行的方法之一。笔者连续3年对田间苜蓿不同茬次病害发生和苜蓿产量数据分析发现，9月中下旬第3茬苜蓿的产量和花叶病害的发病率均约为全年4茬的平均值，可以反映花叶病给苜蓿当年带来的危害。因此，选取当年9月中下旬第3茬初花期(收割前)苜蓿植株作为研究对象，对不同严重度花叶病害对其光合、生长、品质的影响进行了详细的分析。

苜蓿花叶病毒可引起植株矮化，叶或叶柄扭曲变形，叶片黄化斑驳皱缩，逐渐脱叶，严重时可引起植株死亡。叶片褪色及叶面积减少会直接影响叶绿素的含量及植株的光合同化，但目前国内外还未见苜蓿花叶病对作物光合特性影响的相关报道。本研究发现，苜蓿感染花叶病后，叶片的光合能力急剧下降(表1)。严重度1级及以上时，净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)胞间CO2浓度即与健株差异极显著(P ＜ 0.01)。且随着苜蓿花叶病害严重度而急剧下降，当病害严重度为4级时，其Pn仅为健株的6.70%。同时叶绿素的含量也随着花叶病的严重度增加而降低。与樊秦和李彦忠[21]、李扬等[22]、南志标等[23]关于苜蓿茎点霉、假盘菌对苜蓿光合特性影响的结果一致。但寄主不同，病原菌对光合特性的影响也有差异。有文献报道，病害侵染可提高作物的光合速率，如Chang等[24]发现小麦感染叶锈病后，光合速率升高，进而引起叶片中蔗糖积累增加，这是目前报道中的一个例外。

饲草的产量和营养价值是衡量其饲用价值高低的非常重要的指标。粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)的含量是评价其营养价值的主要指标[25]。苜蓿花叶病严重度1级及以上与健株生物量、EE差异极显著(P ＜ 0.01)，ADF差异显著(P ＜ 0.05)；严重度2级及以上与健株CP 差异极显著 (P ＜ 0.01)，NDF 差异显著 (P ＜ 0.05)，说明苜蓿花叶病严重影响了苜蓿的生长及营养价值。这一结果与苜蓿褐斑病对紫花苜蓿草品质的影响以及锈病对3种豆科牧草的生长及营养成分的影响结果基本一致[20-21]。国内外许多类似病害对饲草危害的研究中，虽探讨的病原和寄主不同，但对生长及品质的负面影响却有着一致性[26]。根据本研究中生长、品质与光合参数之间的相关性分析，本研究认为苜蓿花叶病侵染导致叶片黄化斑驳皱缩，叶绿素降解，影响植物的光合作用，进而影响苜蓿生长和品质。